在細胞生物學中，一個常見的問題是如何獲取與細胞功能相關(guān)的各種定量測量信息。在免疫細胞化學中也存在同樣的問題。制作免疫細胞化學標本環(huán)節(jié) 較多，只要有一個環(huán)節(jié) 失誤就會影響實驗結(jié)果，除了需要精制的藥品外，還需要熟練的技術(shù)。那么，做成了理想的標本后，如何進行觀察，才能獲得盡量多的的各種定量信息，而且使這些信息能較客觀的反映出來，這就是本章 的編寫目的。
一、定量分析的重要性
目前有許多研究免疫細胞化學的文章 ，是做定性和定位研究的。如有文獻中提到，P物質(zhì)在腦組織中存在于30處以上，這只是解決了定性定位問題，這些部位含P物質(zhì)的量是否相同？可否用快速簡便的方法對細胞內(nèi)免疫反應(yīng)產(chǎn)物的量進行分析？從而可進行比較。所謂反應(yīng)產(chǎn)物的“量”包括顏色深淺，其所占的長度或面積等，就要借助于圖像分析儀（image analyzer)了。
以往我們對免疫細胞化學或一般組織化學光鏡標本的觀察，對反應(yīng)產(chǎn)物的量常用“+”號表示，一般可分為0～+++，共五個等級，這種方法對差別較大的標本當然還是可以用的，但存在以下三方面的問題：①同一張標本，不同的觀察者可以得到出不同的結(jié)論，因為這種分級沒有明確的客觀標準；②即使同一張標本同一個觀察者，間隔若干天后進行再次觀察時，可能結(jié)論也不一樣的；③最后一點也是最重要的一點，人的視覺是有一定限制的，用一般觀察法實際上已經(jīng)丟失掉了許多可貴的信息，因為你察覺不到實際上存在的較小的差異。因此我們力求有一個客觀的比較精密的標準。除了常用的儀器如顯微分光光度計(microspectrophotometer)和顯微密度計（microdensitometer)等以外，還可用圖像分析儀進行測量。前二者已有許多有關(guān)著作中介紹過，就其精確與靈敏來說都是夠的，但卻不能同時測出標本中某些成分的面積、體積或長度等其他極有用的參數(shù)。圖像分析儀的分析廣度則要大得多，并能明顯地提高工作效率，所得到的各種數(shù)據(jù)可通過分析儀上的計算機進行統(tǒng)計學處理，只要將各種統(tǒng)計學公式輸入計算機，選擇其中你所采用的公式，即可快速得出分析結(jié)果，告訴你有無顯著性差異。
二、圖像分析儀簡介
圖像分析儀又稱圖像分析系統(tǒng)（image analysis system)，主要用來解決如何客觀地較精確地用數(shù)字來表達存在于標本中的各種信息，可稱為數(shù)學形態(tài)學。它已經(jīng)成為一種公認的科學研究工具，并且逐漸展現(xiàn)出巨大的潛能。圖像中包含著極其豐富的內(nèi)容，是人們從客觀世界中獲得信息的重要手段，因此，正確地測量和處理圖像已成為測量技術(shù)中的重要課題，并廣泛應(yīng)用于航空遙感測量、金屬圖像測量、微電子技術(shù)中微圖形檢測、精密機件尺寸檢測，光波干涉圖、醫(yī)學生物學的研究及應(yīng)用等有關(guān)領(lǐng)域中。圖像測量將會隨著信息科學和人工智能的發(fā)展而日益顯示其重要作用�，F(xiàn)代圖像測量是光學、電子學、計算機技術(shù)等相互滲透的跨學科的結(jié)果，涉及廣泛的學科領(lǐng)域，醫(yī)學只是其中一個分支。
我們在光學顯微鏡下看到的是光學圖像，而在圖像分析儀屏幕上看到的是電子圖像，因此在顯微圖像分析中，整個系統(tǒng)最重要最關(guān)鍵的工作就是要保證得到的電子圖像能最精確地反映出光學圖像，這個過程由攝像機（圖像掃描器)、顯像管和圖像處理機（計算機)來完成（圖9-1)。圖像可通過光學顯微鏡、透射電鏡或掃描電鏡傳到攝像機而產(chǎn)生電信號，照片或膠卷上的圖像也可以通過攝像機反映到電視屏幕上進行分析。圖像在電視屏幕上是由許多像素（pixel)構(gòu)成的，單位面積屏幕上像素愈多則圖像愈清晰，即分辨率愈高。各廠家生產(chǎn)各種不同規(guī)格的產(chǎn)品，如有640×480像素的、896×704像素的、512×480像素的屏幕等。當圖像顯示時，每個像素含有兩方面的信息，即此像素的灰度及其在標本中的位置，兩種信息決定了圖像的形狀和顏色深淺。
圖9-1 圖像分析系統(tǒng)簡圖
有關(guān)圖像分析的學術(shù)活動，1963年召開了第一屆國際討論會，此后每四年有一次國際學術(shù)交流活動。1983年在美國召開了第六屆國際學術(shù)會議，與會代表約150人。1987年9月在法國召開了第七屆學術(shù)會議，在200多正式代表中有2/3是生物醫(yī)學方面的專家，而我國生物醫(yī)學界沒有人被邀參加，可見我國過去對如何將圖像分析應(yīng)用于醫(yī)學生物學方面的研究重視得不夠，對國際上這方面的信息掌握得不及時。國內(nèi)自70年代末期相繼從國外引進大型自動圖像分析儀后，80年代才開始將醫(yī)學生物學研究與圖像分析方法結(jié)合起來。從1981～1983年召開了三次全國體視學與圖像圖像分析學術(shù)會議，1987年召開了第四次學術(shù)會議，雖然在宣讀的論文中醫(yī)學研究已占了很大的比例，但具體應(yīng)用到免疫細胞化學則實例極少，僅是一個開端。1988年中國體視學會正式成立，是在民政部登記的屬于新學科的第一個學會。并于1991年11月在重慶第三軍大學召開了“全國計量學在形態(tài)學研究中應(yīng)用研討會”，與會代表來自22個省市，形態(tài)計量學的方法已應(yīng)用到組織學、解剖學、病理學、細胞學等領(lǐng)域。更為可喜的是過去此類研討會都是請外商到會介紹他們的產(chǎn)品，為他們提供中國市場，而此次會議上本國的三家研制生產(chǎn)圖像分析儀的單位在大會上介紹各自的產(chǎn)品，以較好的性能價格比與國外產(chǎn)品競爭，擴大國內(nèi)市場，我國在此領(lǐng)域的研究進展也是很快的。醫(yī).學 全在.線,提供www.med126.com
三、常用的測量方法
（一)灰度
灰度（grey level)指圖像各種分顏色的深淺程度。比較高級的圖像分析儀可將灰度分成為256級，也有的只能將灰度分成64級，總之都是2n,24是26256是28。免疫細胞化學標本上反應(yīng)產(chǎn)物的染色深淺即可用灰度來表示。能將一張標本上不同染色深度區(qū)分為幾十或更多的等級，這是人眼所不及的。因此，某些實驗的結(jié)果，如果用光學顯微鏡作一般的觀察，似乎實驗組與對照組無明顯差異，而用圖像灰度法經(jīng)統(tǒng)計學分析，則可反映出顯著性差異，說明僅僅用顯微鏡觀察是不夠的，在某些情況下可能會辜負了制片過程中所花費的大量精力，而得不到應(yīng)有的結(jié)果。
由于免疫反應(yīng)產(chǎn)物在細胞內(nèi)不一定是均勻分布的，在同一個細胞中就可產(chǎn)生各種灰度，這種情況如何進行比較？有兩類方法可供選用：一種是測每個細胞的平均灰度，近年較新型的圖像分析系統(tǒng)有此性能，而比較早期的或比較簡單的圖像分析系統(tǒng)就沒有這種性能，例如某一細胞在電視屏幕上占有120個像素，按灰度級進行測量后，也許120個像素中有十多種不同的灰度，分析儀可立即顯示其平均灰度。另一種方法是在反應(yīng)產(chǎn)物不均勻的細胞中可用每一種灰度所占的百分率來表示，例如你要觀察1000個細胞，在這些細胞中各種灰度所占的百分率可測出，并作出曲線，或用其他統(tǒng)計學方法處理，來進行比較。
如果用彩色圖像分析儀，除了上述的灰度測量以外，還可以將不同的灰度編成不同的顏色，使圖像更鮮明美麗，而且便于測量。彩色有兩種情況：在屏幕上出現(xiàn)與標本一樣的顏色稱為真色（real color)，如果將不同的灰度轉(zhuǎn)換成不同的顏色則稱為假色（pseudo color)，應(yīng)用假色的目的是增強對比度，來改善對細胞結(jié)構(gòu)的視覺識別，同時可增強輪廓用來強調(diào)結(jié)構(gòu)的細節(jié) 。例如，免疫細胞化學中常用的非標記抗體過氧化物酶—抗過氧化物酶法，最終反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色，假設(shè)在腦內(nèi)某核團的許多細胞中，呈現(xiàn)出不同深度的棕色，深淺差別較大者顯示在屏幕上人眼還能區(qū)別，若差別小的則不易區(qū)別了，操作者可將灰度11～15用紅色顯示，灰度16～20用藍色顯示、灰度21～25用黃色顯示、灰度26～30用綠色顯示等。一般可呈現(xiàn)數(shù)十種顏色。也可以將灰度11～20用深紅色顯示、灰度21～30用淡紅色顯示、灰度31～40用藍色顯示等，由操作者隨心所欲加以編輯。這種圖像如拍攝下來，旁邊顯示出一條彩色帶，表明什么顏色代表什么范圍的灰度，如此可將一種顏色的免疫細胞化學標本轉(zhuǎn)換成多種彩色的，對比鮮明的照片。
有些圖像分析儀中帶有光密度計組件，光密度計能將掃描器視頻信號變換成對數(shù)等值，然后數(shù)值化，就能用絕對光密度單位來校正。因此，光密度計把被測物的積分光密度作為主要輸出，所謂積分光密度即各個單獨探測的像素密度分布的總和。因為容易得到被測物的面積，也就很容易求出平均密度。光密度在細胞化學反應(yīng)的定量領(lǐng)域內(nèi)極為有用�；叶仁且环N相對值，因為你可將標本上的灰度隨你編輯分為64級、也可將其分為128級或者256組，而光密度是絕對值。在文獻中光密度常用OD表示（optical density)。有的單位購置了圖像分析儀后才發(fā)現(xiàn)不能作光密度測量，但已無法再去掉換，所以在購買前必須詳細了解其性能，包括屏幕像素數(shù)、有無光密度計組件等。
