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他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG－CoA)還原酶抑制劑，HMG－CoA還原酶是膽固醇合成酶系中的限速酶，通過對此酶的抑制，此類藥物可阻斷細(xì)胞內(nèi)甲羥戊酸代謝途徑，競爭性抑制膽固醇的生物合成，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇減少等，從而發(fā)揮其降血脂作用。近年來發(fā)現(xiàn)他汀類藥物還具有不依賴于其降脂效果的多樣性的保護(hù)作用,包括抗氧化應(yīng)激作用[4,5]。本文旨在探討辛伐他汀對高糖誘導(dǎo)下牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(retinal bovine retinal endothelial cell,BREC) 血管內(nèi)皮生長因子（vascμlar endothelial growth factor, VEGF)和血管生成素-2（Angiopoietin-2, Ang-2)表達(dá)的作用，并闡明其作用機(jī)制。
2.5 Western blotBRECs加入懸浮裂解液和蛋白酶抑制
劑直接提取蛋白質(zhì)。檢測蛋白質(zhì)濃度 (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA),各樣本稀釋成統(tǒng)一濃度,進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,5％脫脂牛奶TBST（0.05% Tween-20)封閉， 分別用1:1 000 稀釋的Ang-2 多克隆抗體(R&D Systems, Inc.)、VEGF單克隆抗體(Chemicon, Temecula, CA)和1:250 PAR 單克隆抗體(Alexis, San Diego, CA)4℃孵育過夜,洗膜后用1∶5 000稀釋的二抗- 辣根過氧化酶(HRP)交聯(lián)物孵育,發(fā)光 (Super Signal CL-HRP Substrate System; Pierce, Rockford, IL), X光片于室溫下自顯影,使用凝膠分析系統(tǒng)(Gel Doc 1000, Bio-Rad, Hercules, CA)攝像并分析。β-actin表達(dá)作為內(nèi)參(1:5,000; monoclonal anti-β-actin; Sigma Chemical Co. product A 5441)。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。
2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果
使用平均值±SD表示，使用SPSS13.0軟件，運(yùn)用ANOVA進(jìn)行多組間變量分析比較， Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)關(guān)系分析，P值小于0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
3 結(jié)果
3.1 BRECs PARP活性、VEGF和Ang-2表達(dá)同對照組比較，高糖孵育BRECs 72 h，PARP活性增強(qiáng)，VEGF和Ang-2蛋白表達(dá)顯著圖1 各組BRECs PAR化PARP、Ang-2、VEGF蛋白表達(dá)并定量.
**P < 0.01 比 NG, *P < 0.05 比 HG.
性增加（p＜0.01)；辛伐他汀治療后則顯著性降低這些變化（p＜0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀顯著性抑制高糖誘導(dǎo)的VEGF、Ang-2的作用類似于PARP抑制劑PJ-34)。如果高糖聯(lián)合辛伐他汀和甲羥戊酸孵育細(xì)胞，辛伐他汀的這種抑制作用被逆轉(zhuǎn)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ROS清除劑NAC聯(lián)合高糖孵育細(xì)胞可防止PARP激活（PAR化蛋白表達(dá)水平代表PARP活性程度)。
3.2 ROS水平與對照組比較，高糖孵育BRECs 24 h，可誘導(dǎo)ROS生成顯著性增加，而甘露醇對細(xì)胞ROS的生成無明顯作用(圖3)。當(dāng)0.01, 0.1, 1.0, 5.0 and 10μM辛伐他汀分別聯(lián)合高糖培養(yǎng)BRECs，結(jié)果顯示，ROS生成減少，濃度為0.01μM時(shí)有顯著性差異（p＜0.05)；濃度0.1μM以上時(shí)有非常顯著性差異（p＜0.01)，且在濃度為5.0μM時(shí)，這種抑制作用最強(qiáng)。所以本研究選擇5.0μM作為辛伐他汀相關(guān)干預(yù)實(shí)驗(yàn)的作用濃度。如果高糖聯(lián)合辛伐他�。�5.0μM)及甲羥戊酸或GGPP孵育細(xì)胞，辛伐他汀對ROS生成的抑制作用被逆轉(zhuǎn)(圖3)。另外，結(jié)果還顯示，NADPH氧化酶抑制劑DPI可顯著抑制高糖孵育的細(xì)胞ROS生成。醫(yī)學(xué).全在線m.quanxiangyun.cn
3.3 NADPH氧化酶活性和線粒體膜電位水平同對照組比較，高糖孵育BRECs 24 h， NADPH氧化酶活性顯著性增加（p＜0.01)，辛伐他汀治療后則顯著性降低（p＜0.05)。高糖孵育BRECs線粒體膜電位水平與對照組比較顯著性升高（p＜0.01)，辛伐他汀治療后則顯著性減少（p＜0.05)，且這種膜電位水平與ROS水平呈顯著性正相關(guān)（圖4B和C)。
