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護(hù)理論文小議抗ErbB2嵌合抗體chA21聚集現(xiàn)象
1 引言
目前在抗腫瘤的藥物治療方案中，基因工程抗體以其高特異性和低副作用的特點(diǎn)越來越受到重視。但是作為大分子蛋白的抗體在生產(chǎn)和保存過程中經(jīng)常有聚集現(xiàn)象的發(fā)生，不同抗體聚集情況有所差別。研究表明，抗體聚集的性質(zhì)有可逆的和不可逆的，聚集部位可位于可變區(qū)或恒定區(qū)，聚集的程度與抗體本身特性和所處溶液條件密切相關(guān)。聚集可能會對抗體的活性和穩(wěn)定性有所影響，甚至使免疫原性增高，目前已成為抗體藥物開發(fā)的一大挑戰(zhàn)。本實(shí)驗(yàn)室研制的嵌合抗體hA21 是將抗腫瘤相關(guān)抗原ErbB2 的單鏈抗體（sFv)與人抗體F 段融合而成（sFv-F)，并在HO 細(xì)胞中成功以雙價形式表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明，hA21 具有抑制高表達(dá)ErbB2 的乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞生長的作用，目前已建立了適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)與純化的工藝體系，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。本文采取液相色譜等方法對hA21 出現(xiàn)的聚集現(xiàn)象進(jìn)行了分析，并結(jié)合抗體本身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對引起聚集的部位和原因進(jìn)行了初步探索。
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 嵌合抗體hA21
表達(dá)hA21 的HO 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，將細(xì)胞表達(dá)上清收集并經(jīng)過ProteinA 親和層析和SP 離子交換層析兩步純化后保存在0.02 mol/L（pH 5.5，含0.2 mol/L Nal)的醋酸鈉緩沖液中，經(jīng)SDS-PAGE 測定純度可達(dá)95%以上。
2.1.2 儀器
高壓液相分析系統(tǒng)為Agilent 公司產(chǎn)品, S300 分子篩層析柱為Phenomenex 公司產(chǎn)品, 動態(tài)光散射儀為DynaPro 公司產(chǎn)品, 圓二色譜儀為Jaso 公司產(chǎn)品, Protein A 親和柱以及Superdex G75 10/30 純化柱為Amersham 公司產(chǎn)品。
2.1.3 主要試劑蛋
白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Promega 公司，高表達(dá)ErbB2 的T6-17 細(xì)胞裂解液和不表達(dá)ErbB2的3T3 細(xì)胞裂解液為本實(shí)驗(yàn)室保留，96 孔酶標(biāo)板購自Nun 公司醫(yī).學(xué).全.在.線m.quanxiangyun.cn，HRP 標(biāo)記的羊抗人多抗和木瓜蛋白酶購自Piere 公司，顯色底物OPD 購自AMRESO 公司，甘露醇（200 mg/mL)注射液購自豐原藥業(yè)，所有化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。2.2 方法
2.2.1 高效排阻色譜(HPSE)鑒定hA21 聚集現(xiàn)象將兩步純化后的抗體濃度調(diào)整至1 mg/mL，并用0.45 μm 的濾膜過濾，取30 μL 樣品用HPSE S300 進(jìn)行分析。流動相為0.05 mol/L 的pH 7.0 的磷酸鈉緩沖液，含0.3 mol/L的Nal，監(jiān)測波長為280 nm，流速為0.5 mL/min。
2.2.2 動態(tài)光散射（DLS)鑒定hA21 聚集現(xiàn)象
將兩步純化后的抗體濃度調(diào)整至3 mg/mL 并用0.45 μm 的濾膜過濾，取12 μL 加入樣品池。儀器溫度設(shè)為20，激光波長約824 nm，照射角度為90?，樣品加入穩(wěn)定20 min后開始測量，測定結(jié)果取20 個有效數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
