支氣管哮喘大鼠淋巴液中淋巴細(xì)胞線粒體跨膜電位變化及地塞米松對其干預(yù)的影響

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級SD大鼠90只(山東綠葉制藥廠動物中心)，雌雄各半，體重在200～220 g，月齡2～3個月。隨機分為對照組(30只)、哮喘組(30只)，治療組(30只)。

1.1.2 主要試劑和儀器：卵白蛋白(OVA, GradeV、II，美國Sigma公司)。RH��123(美國Sigma公司)，淋巴細(xì)胞分離液(中國科學(xué)院天津試劑廠)，兔抗鼠Fas、FasL檢測試劑盒(武漢博士德生物有限公司)，SABC試劑盒(武漢博士德生物有限公司)，JSC�睴K型單雙通用水電分離式超聲波霧化器(遼寧省鞍山市電子醫(yī)療儀器廠)，EPICS XL流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)，IMAGE�睵RO PLUS圖像分析系統(tǒng)( 美國Media Cybernetics公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠哮喘模型的建立:參照文獻(xiàn)[3]的方法。實驗組大鼠分別于實驗第1天、第8天用新鮮配制的OVA( GradeV) 1 mg + 氫氧化鋁200 mg + 生理鹽水1 ml 混懸液在大鼠兩腹股溝、腹部、前足跖4 個部位做皮下注射(每點0.2 ml),同時腹腔注射0.2 ml。于第15天,將大鼠置于20 cm×20 cm×15 cm大小的密閉容器中,用1%OVA 進行霧化吸入激發(fā),每次霧化30 min ,連續(xù)7 d。對照組大鼠以等量的生理鹽水代替卵白蛋白，同法、同量、同期進行致敏和激發(fā)，治療組霧化吸入前30 min給予地塞米松2 mg/kg(生理鹽水稀釋為0.4 mg/ml)，每只每天腹腔注射。對照組、哮喘組、治療組大鼠分別于激發(fā)后2、6、12、24、48 h 收集取淋巴液、BALF和血液分離淋巴細(xì)胞進行檢測醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站m.quanxiangyun.cn。

1.2.2 大鼠淋巴液的采集：大鼠仰臥位，4%水合氯醛0.1 ml/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒。于劍突恥骨聯(lián)合連線上2/3作腹部正中切口，將腸內(nèi)容物移出腹腔，用溫鹽水紗布包裹。在右腎動脈水平，腸系膜上動脈處尋找腸系膜淋巴干。用留置針插入淋巴管，收集0.5 ml淋巴液。常規(guī)分離淋巴液中淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。

1.2.3 大鼠BALF、血液的收集：打開胸腔，充分暴露頸部,分離氣管, 0號絲線結(jié)扎右主支氣管。切開氣管，行氣管插管，固定，經(jīng)氣管行左肺支氣管肺泡灌洗。用5 ml冷生理鹽水分3次注入，約30 s后回收BALF，回收率高于80%。收集4 ml左右灌洗液4℃ 1 000 r/min，離心10 min，將沉淀細(xì)胞用1 ml PBS懸浮后，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。心臟穿刺取血，收集4 ml左右置于肝素離心管內(nèi)，常規(guī)分離液分離淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞線粒體跨膜電位：分離的淋巴細(xì)胞用PBS清洗2次,加入1ml的終濃度為1 μg/ml Rhoda�瞞ine��123放入37 ℃孵箱里靜置培養(yǎng)45 min;PBS清洗2次,傾去原有液體;250 μl PBS重懸,緩慢加入-20 ℃乙醇750 μl;流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)。

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