| 公開(公告)號 | CN1916173A |
| 公開(公告)日 | 2007.02.21 |
| 申請(專利)號 | CN200610086157.6 |
| 申請日期 | 2006.09.05 |
| 專利名稱 | 人胰高糖素樣多肽-1與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品 |
| 主分類號 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C12N15/14(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 江南大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 金 堅(jiān);竇文芳;張蓮芬;雷楗勇;盧大儒 |
| 地址 | 214036江蘇省無錫市惠河路170號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 |
| 代理人 | 時(shí)旭丹 |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 人胰高糖素樣多肽-1與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法，其特征是人工合成(GLP-1)2cDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴(kuò)增獲得HSAcDNA；利用重疊PCR技術(shù)，連接(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因插入到克隆載體中保存；將(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)； (1)(GLP-1)2cDNA的克�。� 以人工合成(GLP-1)2cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增出(GLP-1)2cDNA，所用的引物如下： PG1：5’-TGCGGATCCCACGGTGAAGGTACTTTCACTTCTGA-3’ PG2：5’-ATAGCGGCCGCTTAACGACCCTTAACCAACCAAGC-3’ PCR方法如下：50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的PG1和PG2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人工合成的(GLP-1)2cDNA 1μg，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl，PCR條件為：95℃變性10分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸20秒，循環(huán)30次； 通瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.2kb的目標(biāo)片段，純化好的目標(biāo)片段和載體pBlue2KSP分別經(jīng)BamHI和NotI雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及BamHI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì)粒BamHI和NotI雙酶切位點(diǎn)間區(qū)域進(jìn)行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue2KSP-(GLP-1)2，陽性重組子命名為DH5α/pBlue2KSP-(GLP-1)2； (2)HSA cDNA的克�。� 利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴(kuò)增出HSA cDNA，所用的引物為： PH1：5’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’ PH2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’ PCR方法如下：50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)30次； 通瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標(biāo)片段，純化好的目標(biāo)片段和載體pBlue2KSP分別經(jīng)SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì)粒SalI和HindIII雙酶切位點(diǎn)間區(qū)域進(jìn)行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue2KSP-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue2KSP-HSA； (3)(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA融合基因的克�。� (GLP-1)2cDNA的PCR擴(kuò)增，所用引物如下： PG3：5’-GAGAGGTACCTAAAAAGACACGGTGAAGGTACTTTCACT-3’ PG4：5’-ACCTCACTCTTGTGTGCATCCCTTCCTTTTACTAACCATG-3’ PCR方法如下：50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的PG3和PG4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue2KSP-(GLP-1)21ng，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次； HSAcDNA的PCR擴(kuò)增，所用引物如下： PH3：5’-CATGGTTAGTAAAAGGAAGGGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’ PH4：5’-TGAACCGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’ PCR方法如下：50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的引物PH 3和PH 4各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue2KSP-HSA 1ng，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次； 利用重疊PCR融合(GLP-1)2cDNA和HSA cDNA： 將(GLP-1)2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和HSA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別稀釋40倍，再以1∶1比例混合后作為模板，于反應(yīng)體系中加入：2mmol/L的dNTP 5μl，10×TaqBuffer 1μl，10mol/LMg2+2.5μl，5U/μl的Taq聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補(bǔ)齊45μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，94℃變性1分鐘，循環(huán)5次后，向反應(yīng)體系中加入10μmol/L的PG3和PH4的引物各1.5μl，繼續(xù)做30次上述循環(huán)； 通瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.9kb的目標(biāo)片段，用T4連接酶連接純化好的目標(biāo)片段和載體pUC18 |
| 摘要 | 人胰高糖素樣多肽-1與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品，屬于長效融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用重疊PCR技術(shù)，將串聯(lián)的兩個(gè)GLP-1基因cDNA(簡稱(GLP-1)2)和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的(GLP-1)2-HSA cDNA融合基因在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)；本發(fā)明的融合蛋白包括與人胰高糖素樣多肽-1至少85％序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區(qū)，兩區(qū)直接連接，中間不加入任何連接肽，該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯�，進(jìn)行個(gè)別氨基酸殘基的取代、缺失或加入。本發(fā)明的融合蛋白在保持了人胰高糖素樣多肽-1的生理特性的基礎(chǔ)上延長其在體內(nèi)的半衰期，在藥學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。 |
| 國際公布 |
