| 公開(公告)號 | CN1873012A |
| 公開(公告)日 | 2006.12.06 |
| 申請(專利)號 | CN200510026345.5 |
| 申請日期 | 2005.06.01 |
| 專利名稱 | 重組腺相關(guān)病毒（rAAV)載體大規(guī)模生產(chǎn)新工藝 |
| 主分類號 | C12N15/861(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/861(2006.01)I;C12N5/06(2006.01)I;C12N5/10(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 上海二醫(yī)新生基因科技有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 裘建英;張?jiān)聘?董西銀 |
| 地址 | 201611上海市松江區(qū)車墩鎮(zhèn)車亭公路128號B-1/10 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 重組腺相關(guān)病毒(rAAV，recombinant Adeno-Associated Virus)載體的大規(guī)模生產(chǎn)化工藝，其新穎性包括以下各步驟的多項(xiàng)參數(shù)的改進(jìn)，具體生產(chǎn)工藝步驟如下： (1)細(xì)胞種子擴(kuò)大 取50L發(fā)酵罐所要的HEK293細(xì)胞庫的種子細(xì)胞，接種HEK293至專用發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐培養(yǎng)基在接種前預(yù)熱至37℃，用二氧化碳來平衡培養(yǎng)液的pH，發(fā)酵罐在發(fā)酵培養(yǎng)中能自動(dòng)檢測各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)(如：氧分壓、二氧化碳分壓、pH值、溫度、葡萄糖濃度、氨濃度、呼吸比等)，細(xì)胞在發(fā)酵罐中培養(yǎng)至所需的培養(yǎng)密度約需3-4天的時(shí)間，每天檢測細(xì)胞生長的密度，中間的培養(yǎng)液更換和補(bǔ)充以程控儀表顯示參數(shù)為依據(jù)，培養(yǎng)液為無血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)工藝中本發(fā)明改進(jìn)由轉(zhuǎn)瓶到發(fā)酵罐大容量懸浮培養(yǎng)和無血清培養(yǎng)，用懸浮培養(yǎng)方法代替貼壁培養(yǎng)，使大規(guī)模培養(yǎng)更易操作，也降低了培養(yǎng)液自身帶來的動(dòng)物源性污染，提高產(chǎn)品的安全性。 (2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體包括ITRs攜帶目的基因功能區(qū)；AAV的Rep啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄子系統(tǒng)Cap；腺相關(guān)病毒的輔助系統(tǒng)質(zhì)粒是腺病毒的表面蛋白的基因，整個(gè)轉(zhuǎn)染過程是包裝質(zhì)粒與HEK293共轉(zhuǎn)染。當(dāng)HEK293細(xì)胞培養(yǎng)到適當(dāng)?shù)拿芏�，約占培養(yǎng)密度的80％左右，歷時(shí)5天時(shí)間，將適量的rAAV質(zhì)粒加入發(fā)酵罐中，進(jìn)行轉(zhuǎn)染培養(yǎng)。質(zhì)粒行將轉(zhuǎn)染時(shí)，發(fā)酵罐暫時(shí)停止轉(zhuǎn)動(dòng)，加入質(zhì)粒后作輕微攪拌后，再停止一小時(shí)，再輕微攪拌幾次，再停止一小時(shí)，在約5-6小時(shí)內(nèi)，每小時(shí)作相同動(dòng)作，使rAAV與HEK293細(xì)胞能很好地受到轉(zhuǎn)染，直至大部分細(xì)胞受到轉(zhuǎn)染。值得一提的是HEK293在發(fā)酵罐中培養(yǎng)的基本條件，盡量提供與體內(nèi)生活條件相接近的培養(yǎng)環(huán)境，培養(yǎng)環(huán)境應(yīng)具備以下幾個(gè)因素：所有與細(xì)胞接觸的設(shè)備、器材、溶液等，其中包括種子庫細(xì)胞培養(yǎng)和放大培養(yǎng)及生產(chǎn)培養(yǎng)過程，都必須保持絕對無菌，避免細(xì)胞外微生物的污染，必須有充足的營養(yǎng)供應(yīng)，絕對不能含有有害的物質(zhì)，甚至極微量有害離子；保證有適量的氧氣供應(yīng)；及時(shí)清除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)；有良好的適宜細(xì)胞生存的外界環(huán)境，包括滲透壓、離子濃度、氨基酸濃度、氧分壓、二氧化碳分壓、葡萄糖濃度、pH值等，保持合適的細(xì)胞密度。 (3)營養(yǎng)更新(介質(zhì)更新) 細(xì)胞在培養(yǎng)過程中由于細(xì)胞自我的代謝需要，將吸取營養(yǎng)物質(zhì)，排出代謝產(chǎn)物，在大容量的培養(yǎng)過程中，要及時(shí)補(bǔ)充各種營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣等，也要及時(shí)清除代謝產(chǎn)物如二氧化碳、氨等，特別在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前，要先更新和補(bǔ)充培養(yǎng)液，使質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過程中，細(xì)胞能大多受到轉(zhuǎn)染，增加轉(zhuǎn)染率，進(jìn)一步提高產(chǎn)量。 (4)細(xì)胞收集 當(dāng)HEK293與rAAV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)，達(dá)到收集的時(shí)候時(shí)，將細(xì)胞全部收集。可收集程度的指標(biāo)，依照抽樣經(jīng)顯微鏡下觀察已有大量細(xì)胞產(chǎn)生報(bào)告基因Lacz比例，或肉眼觀察，見大量細(xì)胞呈簇狀，此時(shí)也可以收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞和培養(yǎng)液進(jìn)行過濾或離心，富集細(xì)胞。 (5)細(xì)胞破壁和純化 富集的細(xì)胞經(jīng)勻漿機(jī)(或超聲波)破壁，然后離心除去細(xì)胞碎片，作過柱的預(yù)處理，在快速純化儀中快速過柱純化，最后將病毒液轉(zhuǎn)移至透析袋，在4℃下透析，后經(jīng)安全性和生物活性檢測，即得到所需的GMP條件下重組腺相關(guān)病毒載體的產(chǎn)品。 1.如權(quán)利要求所述的重組腺相關(guān)病毒載體的生產(chǎn)工藝，細(xì)胞生產(chǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)全程控制的發(fā)酵罐進(jìn)行。 2.如權(quán)利要求所述的重組腺相關(guān)病毒載體的生產(chǎn)工藝，細(xì)胞種植中的接種細(xì)胞為HEK293細(xì)胞，rAAV和HEK293細(xì)胞的繁殖和感染過程中，感染方法是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。HEK293與rAAV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率高達(dá)90％以上。 3.如權(quán)利要求所述的重組腺相關(guān)病毒載體的生產(chǎn)工藝，純化技術(shù)采用AmershamBioscience Source 15Q或快速純化技術(shù)。 4.如權(quán)利要求所述的重組腺相關(guān)病毒載體的生產(chǎn)工藝，產(chǎn)品以水劑(rAAV載體+保護(hù)液)和凍干的形式在4℃的冰箱或冰凍柜中保存、運(yùn)輸，以保證產(chǎn)品的生物活性。 5.如權(quán)利要求所述的重組腺相關(guān)病毒載體的生產(chǎn)工藝，重組體的目的基因是各種疾病有治療作用的基因(DNA，RNA分子和寡核苷酸)，其治療范圍包括：癌癥、心腦血管疾病、老年性疾病、內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病、血液性疾病和遺傳性疾病。 6.如權(quán)利要求所述的重組腺相關(guān)病毒載體(攜帶治療基因)的產(chǎn)品的受試者是人。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體在GMP條件下大規(guī)模生產(chǎn)的新工藝，解決了腺相關(guān)病毒載體從實(shí)驗(yàn)室的小量生產(chǎn)，擴(kuò)大到在GMP條件下的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的系列難題，使腺相關(guān)病毒載體(攜帶基因治療)藥物的規(guī)模生產(chǎn)成于現(xiàn)實(shí)。生產(chǎn)工藝步驟包括：細(xì)胞種子擴(kuò)大，細(xì)胞培養(yǎng)；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；營養(yǎng)更新；細(xì)胞收集；破壁和純化；產(chǎn)品罐裝和儲存。新的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)用在大規(guī)模生產(chǎn)上，既解決了腺相關(guān)病毒產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，又克服輔毒帶來的安全性問題。生產(chǎn)工藝具有良好的可控性和操作性，整個(gè)生產(chǎn)工藝保證了產(chǎn)品的生物活性，新工藝具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。 |
| 國際公布 |
