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公開(公告)號
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CN1277927C
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公開(公告)日
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2006.10.04
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申請(專利)號
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CN200410025403.8
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申請日期
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2004.06.17
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專利名稱
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家蠶作為宿主生產(chǎn)重組人bFGF的方法
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主分類號
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C12N15/12(2006.01)I
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分類號
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C12N15/12(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C12N15/866(2006.01)I;C12N5/10(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I;C07K1/14(2006.01)I
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權
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申請(專利權)人
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浙江大學
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發(fā)明(設計)人
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吳小鋒;曹翠平;姚慧鵬
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地址
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310027浙江省杭州市西湖區(qū)浙大路38號
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構
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杭州求是專利事務所有限公司
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代理人
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林懷禹
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國省代碼
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浙江;33
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主權項
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一種家蠶作為宿主生產(chǎn)重組人bFGF的方法，其特征在于：(1)bFGF基因的克隆：以人腦cDNA為模板，PCR基因擴增技術獲得人bFGF基因，引物設計如下：正向引物：5′-ACGTAGATCTCCCGCCTTGCCCGAG-3′含有BglII酶切位點；反向引物：5′-ACGTAGATCTTCAGCTCTTAGCAGA-3′，含有BglII酶切位點；PCR反應的循環(huán)數(shù)、溫度和時間的設計如下：一個循環(huán)，94℃模板變性50秒；30個循環(huán)，55℃退火30秒，70℃延伸1分鐘；最后1個循環(huán)，70℃延伸10分鐘；利用1％瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產(chǎn)物分析，并用Qiagene的PCR純化試劑盒純化，隨后將目的PCR產(chǎn)物克隆入3.9kb載體pCR2.1，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認克隆bFGF基因順序正確性；(2)含有人bFGF基因的重組桿狀病毒的構建：用限制性內切酶BglII消化pCR2.1-bFGF得到bFGF基因片段，然后克隆入桿狀病毒轉移載體pAcGP67b獲得重組體pAcGP67b-bFGF；通過共轉染在昆蟲細胞內與雜交桿狀病毒HyNPVDNA同源重組產(chǎn)生重組病毒，共轉染的方法為：1μgpAcGP67b-bFGFDNA和15μgHyNPVDNA混合，并加入14μl脂質體lipofectin，最后加入滅菌蒸餾水至終體積40μl；將該混合液在室溫培育15分鐘后共轉染對數(shù)生長期的Sf21培養(yǎng)細胞；先用無血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后，換成含有10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒原液，用來篩選重組病毒；重組病毒通過3輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的病毒溶液，濃度為108pfu/ml；(3)家蠶體內表達和重組bFGF純化：使用家蠶幼蟲5齡起蠶，接種上述重組病毒進行感染表達；接種前將幼蟲浸在冰水浴中進行短時間麻醉，然后采用皮下注射的方法注射重組病毒懸浮液，濃度為106pfu/ml，每條家蠶注射20μl，注射1小時后喂桑，并在23-25℃下飼養(yǎng)；感染后72-96小時內收集家蠶幼蟲，解剖感染家蠶的脂肪體，并用此作為純化重組人bFGF的起始材料；將脂肪體勻漿后溶解在預冷的pH7.6，20mMTris-HCl緩沖液中，經(jīng)高速離心后將上清液直接上肝素Heparin親和層析柱，由于bFGF與肝素具有強烈的親和性而使bFGF結合到層析柱上，然后用含有0.4MNaCl的上述同樣緩沖液洗脫去掉雜蛋白，最后用2.0MNaCl的緩沖液一步洗脫出結合的bFGF；通過SDS-PAGE電泳分析鑒定重組蛋白，結果顯示獲得的重組bFGF純度很高；(4)重組bFGF活性分析鑒定：用人臍靜脈內皮細胞HUVEC分析重組人bFGF的生物活性；細胞在培養(yǎng)基199中37℃培養(yǎng)，補充5％的CO2，培養(yǎng)基中另外添加100units/ml青霉素，100units/ml鏈霉素，4.0mg/ml兩性霉素B，20％熱滅活補加牛血清，5units/ml肝素和50mg/ml內皮細胞生長補充物質ECGS；細胞用胰蛋白酶消化后接種于24孔組織培養(yǎng)板，細胞密度大約為1.0×104cells/well，每孔加1ml同樣的培養(yǎng)基；24小時后，將培養(yǎng)基更換為含有10％SCS和5units/ml肝素，但是不含有ECGS的新鮮培養(yǎng)基199；純化的重組bFGF經(jīng)梯度稀釋后用0.22μm滅菌過濾器過濾滅菌，加入到培養(yǎng)板孔中，每孔體積不超過10μl；72小時后，用PBS洗兩次，用胰蛋白酶消化后離心收集細胞，重懸于200μlPBS中；0.4％臺酚藍染色后，用血球計計算細胞個數(shù)；結果表明，重組bFGF能夠刺激HUVEC細胞的分裂、增殖，表明家蠶幼蟲中表達的重組人bFGF具有生物學活性。
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摘要
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本發(fā)明公開了一種家蠶作為宿主生產(chǎn)重組人bFGF的方法。利用構建的AcNPV和BmNPV的雜交桿狀病毒HyNPV作為載體，構建了重組含有人bFGF基因的重組病毒。利用家蠶作為重組病毒的宿主，表達了具有生物活性的重組人bFGF。解決了bFGF在大腸桿菌中表達需要復雜的復性操作、酵母表達中質粒轉化體不穩(wěn)定和在哺乳動物培養(yǎng)細胞生產(chǎn)的成本太高的缺點，家蠶幼蟲表達的重組人bFGF大部分留在家蠶脂肪體內，利用親和層析從脂肪體中純化bFGF，每頭家蠶的產(chǎn)量高達600-700μg。活性分析表明，重組bFGF具有促進細胞分裂增殖的生物活性。利用家蠶作為宿主可以大量生產(chǎn)重組bFGF，在醫(yī)學和治療領域上的應用開辟了廣闊的前景。
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國際公布
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