| 公開(公告)號 | CN1693461A |
| 公開(公告)日 | 2005.11.09 |
| 申請(專利)號 | CN200510039063.9 |
| 申請日期 | 2005.04.26 |
| 專利名稱 | 一種抗醛糖還原酶蛋白單克隆抗體的制備與鑒定方法 |
| 主分類號 | C12N15/13 |
| 分類號 | C12N15/13;C12N15/10;C12N15/70;C07K16/40;C12P21/08;C12N5/18;C12Q1/68;G01N33/53 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 東南大學 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 謝 維;馬 達;金俊飛;張建瓊 |
| 地址 | 210096江蘇省南京市四牌樓2號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 |
| 代理人 | 葉連生 |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項 | 一種抗醛糖還原酶“AR”單克隆抗體的制備方法，其特征在于該方法為：①從正常人胎盤組織提取總RNA；②根據(jù)已知AR序列，并使用“clustalx、antheprot”軟件得到AR的抗原性分區(qū)、以及AR與醛糖還原酶相似蛋白“ARL-1”的序列比對同源性分區(qū)，針對AR全長、以及分別命名為dAR、dA1、dA2、dA3、dA4的五段截短部分設(shè)計六對引物，上游引物均含EcoRI酶切位點gcgaattc，下游引物均含NotI酶切位點gcggccgc；③通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應“RT-PCR”獲得AR全長及dAR、dA1、dA2、dA3、dA4五段截短基因；④采用基因重組手段，將以上獲得的AR全長及dAR、dA1、dA2、dA3、dA4五段截短基因，共六段基因分別插入表達載體pGEX-4T-1(His)6C，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliRosetta，誘導表達AR全長及截短蛋白，獲得GST-AR蛋白及GST-dAR、GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4截短蛋白；⑤采用雜交瘤技術(shù)制備抗AR單克隆抗體：將純化的全長醛糖還原酶蛋白—谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶“GST-AR”重組蛋白免疫“Balb/c”小鼠，制備脾細胞懸液，在聚乙二醇“PEG”作用下與處于對數(shù)生長期的Sp2/0骨髓瘤細胞進行融合，將融合細胞培養(yǎng)于含次黃嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶“HAT”的培養(yǎng)基；利用純化的GST-AR蛋白包被酶標板，同時GST包被酶標板作為對照，根據(jù)方陣滴定結(jié)果，AR按1∶5000包被，GST按1∶3000包被，包被量均為100ng/孔；將待測的每一個雜交瘤集落孔的培養(yǎng)上清同時等量加入包被GST-AR和包被GST的酶標板孔，同時在GST-AR和GST包被系統(tǒng)分別設(shè)三孔為對照，一孔加新鮮細胞培養(yǎng)液作為空白對照，另一孔在新鮮細胞培養(yǎng)液中加入1ul免疫小鼠的血清作為陽性對照(P)，還有一孔在新鮮細胞培養(yǎng)液中加入1ul正常小鼠的血清作為陰性對照(N)，采用間接酶聯(lián)免疫吸附實驗“ELISA”法進行檢測，TMB底物顯色，測定OD450值；P/N≥2.1，表示包被系統(tǒng)有效，GST-AR陽性(P1)，同時GST陰性(N1)，P1/N1≥2.1者為陽性，陽性對應的原細胞培養(yǎng)孔用有限稀釋法亞克隆2～3次，至100％培養(yǎng)孔陽性，擴大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定分泌抗AR蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系，獲得三株能穩(wěn)定分泌抗AR單克隆抗體的細胞株，分別命名為ARB3、AR7B3G4、ARF10；將細胞培養(yǎng)在含20％新生牛血清“FCS”的RPMI1640培養(yǎng)液中，收集細胞培養(yǎng)上清，純化上清得到三株抗醛糖還原酶單克隆抗體。 |
| 摘要 | 抗醛糖還原酶蛋白“AR”單克隆抗體的制備與鑒定方法產(chǎn)生的抗AR單克隆抗體分別高度特異抗AR抗原的不同區(qū)段；產(chǎn)生的抗AR單克隆抗體可以作為一種新的肝癌早期診斷輔助試劑：聯(lián)合應用抗AR單克隆抗體和抗醛糖還原酶相似蛋白“ARL-1”單克隆抗體，可能找到一個新的、特異性高的肝癌早期診斷指標，將有助于肝癌的早期診斷，從而提高肝癌的生存率，改善其預后。經(jīng)鑒定，由純化ARB3、AR7B3G4、ARF10細胞株的培養(yǎng)上清而得到的三株抗AR單克隆抗體，Ig亞類均為IgG1，輕鏈屬于κ型；均抗GST-AR，并與胎盤組織中的AR蛋白反應，且分別識別AR第1～79氨基酸、第111～142氨基酸、第143～316氨基酸位置，而與GST-ARL、GST、表達菌液蛋白無交叉反應。 |
| 國際公布 |
