| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1544630A |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2004.11.10 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200310108658.6 |
| 申請(qǐng)日期 | 2003.11.12 |
| 專利名稱 | 重組鴨白介素2蛋白的制備方法及其用途 |
| 主分類號(hào) | C12N15/26 |
| 分類號(hào) | C12N15/26;A61K39/39;A61K39/395;A61P37/06;C07K14/55 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 浙江大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 周繼勇;王金勇;吳建祥;陳吉?jiǎng)? |
| 地址 | 310027浙江省杭州市西湖區(qū)浙大路38號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 |
| 代理人 | 張法高 |
| 國(guó)省代碼 | 浙江;33 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種重組鴨白介素2制備方法，其特征在于它的步驟如下：1)自中國(guó)的紹興麻鴨和外來(lái)品種美洲鴨的脾淋巴細(xì)胞中克隆出鴨白介素-2的cDNA與含有PBAD啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體pBAD/hisB組建成高效表達(dá)載體pBAD/HisB/dkIL-2；或者與含有PAUG1啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體pMETαA組建成高效表達(dá)載體pMETαA/dkIL-2；2)用RM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)發(fā)酵擴(kuò)增大腸桿菌工程菌LMG194；3)用BMDY作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)發(fā)酵擴(kuò)增酵母工程菌PMAD11和PMAD16，在表達(dá)不同時(shí)間加氮源、碳源營(yíng)養(yǎng)素；4)大腸桿菌LMG194誘導(dǎo)后經(jīng)超聲波裂解、離心去沉淀即可得到鴨白介素2粗制品，PMAD11和PMAD16表達(dá)的鴨白介素2主要以分泌形式存在于培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)離心取上清即可得到鴨白介素2粗制品；用Ni-NTAArgarose蛋白純化系統(tǒng)可得到鴨白介素2純品；5)制備的重組鴨白介素2純品或非純品加入甘氨酸等穩(wěn)定劑和助溶劑后，無(wú)菌過(guò)濾、分裝和凍干后制成的成品，保存于-20℃的冷藏環(huán)境中；6)鴨白介素2單克隆抗體的制備：用重組鴨白介素2純品抗原免疫小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，雜交瘤細(xì)胞及陽(yáng)性孔的篩選，陽(yáng)性孔的特異性檢測(cè)及特異性陽(yáng)性孔的克隆，液氮保存。獲得的單克隆抗體腹水純化后，液氮保存；7)鴨白介素2多克隆抗體的制備：用鴨白介素2純品抗原0.3-0.5mg，加等體積弗氏完全佐劑初次背部皮下注射免疫健康兔子，3周后加等體積弗氏不完全佐劑以同樣抗原劑量二次免疫，3周后不加佐劑其它同與前面操作進(jìn)行三次免疫；7-10天后采血清，試血測(cè)其效價(jià)再次加強(qiáng)免疫，7天以后采血清測(cè)效價(jià)，瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)1∶32-64，離心取上清低溫保存。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開(kāi)了一種重組鴨白介素2蛋白制備方法及其用途。RT-PCR擴(kuò)增的不同品種鴨的鴨白介素-2cDNA片段與原核表達(dá)載體pBAD/his B載體和真核表達(dá)載體pMETαA構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒，重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌LMG194和酵母菌株P(guān)MAD11和PMAD16后誘導(dǎo)表達(dá)。大腸桿菌誘導(dǎo)后經(jīng)超聲波裂解、離心去沉淀即可得到鴨白介素-2粗制品，用蛋白純化系統(tǒng)得到鴨白介素2純品。鴨白介素-2粗制品或純品加保護(hù)劑后可以作為免疫佐劑、抗病添加劑和疾病治療藥物。鴨白介素-2單克隆抗體和多克隆抗體的制備過(guò)程簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，可以作為良好的免疫抑制劑。本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)制備的重組鴨白介素-2蛋白，具有工藝流程簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，穩(wěn)定性好，生物學(xué)活性高等特點(diǎn)。 |
| 國(guó)際公布 |
