 |
一 基本原理
(一)原理
層析技術是近代生物化學最常用的分離技術之一，它是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)（吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等)的差異，在物質(zhì)經(jīng)過兩相（一個固定相，一個流動相)組成的體系中，不斷地進行交換、分配、吸附及解吸附等過程，可將各組分間的微小差異經(jīng)過相同的重復過程而達到分離。配合相應的化學、電學和電化學檢測手段，可用于定性、定量和純化某種物質(zhì)。層析法的特點是分離率、靈敏度、選擇性均很高的一種分離方法。尤其適合樣品含量少，而雜質(zhì)含量多的復雜生物樣品的分析。固定相可以是固體也可以是被固體或凝膠所支持的液體；同樣流動相可以是液體也可是氣體。
(二)分類
按分離的原理可分為五類：
１、吸附層析： 固定相是固體吸附劑，利用各組分在吸附劑表面吸附能力的差別而分離。
２、分配層析： 固定相為液體，利用各組分在兩液相中分配系數(shù)的差別或溶解度不同使物質(zhì)分離。
３、離子交換層析： 固定相為離子交換劑，利用各組分對離子交換劑的親和力不同而進行分離。
４、凝膠層析： 固定相為多孔凝膠，利用各組分在凝膠上受阻滯程度不同而進行分離。
５、親和層析：根據(jù)生物特異性吸附進行分離，固定相只能和一種待分離組分有高度特異性的親和能力者結合，而與無結合能力的其它組分分離。
按操作方式不同分為三類：
１、紙層析 以濾紙作為液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到組分分離目的。
２、薄層層析 以一定顆粒度的不溶性物質(zhì)，均勻涂鋪在薄板上。點樣后，用流動相展開，使組分達到分離。
３、柱層析 將固定相裝柱后，使樣品沿一個方向移動，以達到分離目的。
二 吸附層析
(一)原理
吸附作用是指某些物質(zhì)（稱吸附劑)能夠從溶液中將溶質(zhì)濃集在其表面的現(xiàn)象。吸附劑吸附能力的強弱除決定于吸附劑和被吸附物質(zhì)本身的性質(zhì)外，還和周圍溶液的組成有密切關系。當改變吸附劑周圍溶液的成分時，吸附劑的吸附能力即可發(fā)生變化，往往可使能吸附物質(zhì)從吸附劑上解吸下來，這種解吸過程稱為洗脫或展層。當樣品中的物質(zhì)被吸附劑吸附后，用適當?shù)南疵撘簺_洗，就能改變吸附劑的吸附能力，使被吸附的物質(zhì)解吸下來，隨著洗脫液向前移動，該物質(zhì)又遇到前面新的吸附劑而再次被吸附，在后來的洗脫液的沖洗下又重新解吸下來，繼續(xù)向前移動。經(jīng)過這樣反復的吸附—解吸附—再吸附—再解吸的過程，物質(zhì)就可以不斷向前移動。由于吸附劑對樣品中各組分的吸附能力不同，它們在洗脫劑的沖洗下移動的速度也就不同，因而能逐漸分離開來。
(二)吸附劑的選擇
吸附劑的選擇是否合適是吸附層析的關鍵。常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、硅藻土、纖維素等。硅膠為微酸性吸附劑，適合分離酸性和中性物質(zhì)；氧化鋁是微堿性吸附劑，適合分離堿性和中性物質(zhì)；硅藻土和纖維素為中性吸附劑，適合分離中性物質(zhì)。m.quanxiangyun.cn吸附劑的顆粒應有一定細度，并且粒度要均勻。一般顆粒直徑為無機類0.07～0.1mm（150～200目)；有機類0.1～0.2mm（70～140目)。顆粒太粗，層析時溶劑推進快，但分離效果差，而顆粒太細，展開太慢，易產(chǎn)生斑點不集中并有拖尾現(xiàn)象。
(三)吸附能力
一般用活度來表示吸附劑的吸附能力，吸附能力主要受吸附劑含水量的影響，其由強到弱的程度以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表示。吸附劑活度強時能吸附極性較小的基團；吸附劑活度弱時對非極性基團吸附能力也較強。一般利用加熱烘干的方法，減少吸附劑的水份，從而增加其活度。通常，分離水溶性物質(zhì)時，因其本身具有較強極性，故吸附劑活度要弱一些；相反，分離脂溶性物質(zhì)時，吸附劑活度要強一些。
吸附層析根據(jù)吸附劑的裝填方式可分為柱層析和薄層層析法兩種。
（１)吸附柱層析法 選擇一根適當尺寸的玻璃管，在管的底部墊以尼龍網(wǎng)、玻璃棉或燒結玻璃板等，再填裝一定量的吸附劑，然后在頂部加入樣品溶液，待樣品全部流入吸附劑內(nèi)后，再加入洗脫液進行洗脫，不同組分即以不同的速度向下流動而逐漸分離開來。最后從下端出口處流出，分步收集洗脫液，即可得到各組分的溶液，供進一步處理和測定。
（２)吸附薄層層析法 薄層層析法是把吸附劑均勻地在玻璃板上鋪成薄層。把要分析的樣品加在薄層的一端，在密閉的容器中，用適當?shù)娜軇┱箤雍筮_到分離、鑒定的目的。
薄層層析的優(yōu)點是：設備簡單、操作容易、層析時間短、分離效率高，是發(fā)展較快的一種微量，快速的層析方法，可用于氨基酸、核苷酸、糖類、脂類和激素等物質(zhì)的分離和鑒定。
薄層層析的操作方法包括制薄板、點樣、展層、顯色等過程，薄層經(jīng)顯色確定斑點位置后，計算Rf值。然后與文獻記載的Rf值比較以鑒定各種物質(zhì)。
