動脈粥樣硬化:第二節(jié)　載脂蛋白純品的鑒定

載脂蛋白分離純化后，獲得了所需要的純品，該純品純度及其品種可通過下述方法進行鑒定。

一、免疫電泳法

免疫電泳法既可用于鑒定蛋白種類，又可鑒定其純度。

制備1%的瓊脂糖，以0.1mmol/L巴比妥緩沖液（0.05μ,pH8.6)為溶劑，制作一塊約7×4cm的大小，厚度為0.2～0.3cm的瓊脂糖凝膠，以玻璃板或薄膜為支持物，于凝膠正中打孔（直徑0.2cm)。1孔加全血清5μl，2孔（中間孔)加純化的某產品，3孔加已知某載脂蛋白。電泳電極液為0.05μ，pH8.6的巴比妥緩沖液。當標本前沿泳動到距離凝膠端1cm左右，停止電泳，取出凝膠板，在凝膠板三孔之間開兩條寬0.2cm，長5～5.5cm長的凝膠槽。1與2孔之間的凝膠槽（A槽)中加入羊抗人全血清抗體，2與3孔之間的凝膠槽（B槽)加入羊抗人某Apo單價特異抗血清，將凝膠板置于含少量水的大平皿中，加蓋，水平置于37℃培養(yǎng)箱24h，再觀察弧形白色沉淀線，與A槽沉淀線位置比較若位置完全相同，初步可以確認為2孔純化產品與3孔標準蛋白是同一蛋白質，如圖17-7所示。

圖17-7 免疫電泳圖（瓊脂糖凝膠)

A：1、2、3分別為抗人ApoAⅠ血清（第一化學)、抗人全血清，抗人ApoAⅠ血清（自制)；a、b、c、d分別為ApoAⅠ純品（純化產品)、人血清、人血清、ApoAⅠ純品（sigma)

B:1、2分別為抗人全血清，抗有ApoB血清（自制)：a、b、c分別為人血清、人血清和人ApoB純品（自制)

二、免疫火箭電泳

按本章節(jié)的方法進行操作，若為單一火箭沉淀峰，也可判純化產品為單一蛋白，如圖17-8所示。

三、免疫雙擴散法

制備1%瓊脂糖凝膠（0.05μ，pH8.6的巴比妥緩沖液為溶劑)，按圖打孔。圖17-9中孔加入已知某Apo單價特異羊抗人血清，周邊第1孔加純化產品，第2孔加已知某Apo純品，置37℃培養(yǎng)箱24h，若第1與2孔旁兩條白色沉淀線相互融成一個弧形，無分叉，表明1孔與2孔的蛋白質與中孔抗血清的抗有相同的抗原性，可確認為同一蛋白質。

17-8 免疫火箭電泳圖

A：瓊脂糖凝膠板含抗人全血清、抗原孔含人ApoAⅠ純品；

B：瓊脂糖凝膠析含抗人全血清、抗原孔含人ApoB純品。

圖17-9 各種抗原抗體系的沉降線示意圖

1，2：同一抗原抗體系（complete identity)

3m.quanxiangyun.cn/zhuyuan/：不同的抗原抗體系（nonientity)

4：部分相同的抗原抗體系（partialidentity)

四、等電聚焦電泳

利用IEF-PAGE測等電點，根據(jù)等電點確認蛋白質性質。

五、蛋白質分子量測定

從化學觀點考慮，分子量是組成蛋白質分子的各原子量總和。但是，對大分子的蛋白質來講，若不知道分子量也無法得知每個分子的元素組成情況。為此，人們在蛋白質的研究中，對測定其分子量工作極為重視，先后用于測定蛋白質分子量的方法有滲透壓、粘度、光散射、蛋白質氨基酸序列分析法、超速離心（沉降速度或沉降平衡)、凝膠層析和SDS-PAGE等法。載脂蛋白分子量測定多采用超速離心沉降速度法、凝膠層析法和SDS-PAGE法。

凝膠法層析用：1gM=A-B（V_e/Vo)

SDS-PAGE用：lgM=A-BR_f

式中，對已知標準樣品，x和y分別為實驗值和已知值。n是實驗的點數(shù)。采用上述兩個方程，由已知樣品的數(shù)據(jù)，可以求出標準線的兩個常數(shù)A、B值。對未知樣品，只要測出x，利用A、B值可以計算出y值�？傊�，從實驗測得的數(shù)據(jù)計算該實驗方法所用方程的常數(shù)，再用這個常數(shù)計算出未知樣品的分子量，所得結果比作圖法精確，且很方便。

下文僅介紹SDS-PAGE作圖法測定蛋白質的分子量。

十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS)是一種陰離子去污劑，于100℃加熱，在β-巰基乙醇存在下，可以使大多數(shù)多聚體蛋白質的四級結構解體，并與各亞基牢固地結合，從而遮蔽了蛋白質分子上原有電荷，同時帶上強的負電荷。

由于所有的SDS-蛋白質復合物（圖17-10)，在電泳時都以同樣的電荷按分子量大小不同向正極移動，作SDS聚丙烯酰胺凝膠泳動（SDS-PAGE)時，其泳動速度僅決定于蛋白質的分子量。SDS與蛋白質的結合是成比例的，所以SDS-蛋白質復合物在泳動中的不同速率，就反映了分子量的不同。與分子量的對數(shù)和相對遷移率成一定比例關系。使用已知分子量的標準物作標準曲線（圖17-11，圖17-12)或用計算法確定標準曲線的常數(shù)，即可求出未知樣品的分子量。用這種方法測定的分子量是亞單位肽鏈的分子量。

圖17-10 SDS對蛋白質四級結構的破壞作用，SDS與亞基牢固地結合，遮蔽了蛋白分子的原有電荷

實驗結果也可以通過公式運算求蛋白質分子量：

先求得遷移率Rf，Rf=d_e/d_o

d_e為樣品遷移距離，d_o為前沿遷移距離（染料)

從幾種標準樣品的Rf值和分子量對數(shù)，用最小二乘法能準確地求得a、b二常數(shù)，從而可進行未知物分子量的計算。

圖17-11 人ApoAⅠ分子量測定圖（SDS-PAGE)

圖17-12標準蛋白質分子量測曲線（SDS-PAGE)

1為蛋白質標準分子量（LKB)：

2為ApoAⅠ純品（Sigma)；

3為ApoAⅠ純品（自制)

SDS-PAGE的分子量測定簡要步驟是：①制備4%～30%的聚丙烯酰胺梯度凝膠；②待測蛋白純品和標準分子量標本的制備，按蛋白樣品1mg/ml濃度溶于含有20%蔗糖的電極緩沖液中，加入5μl0.1%溴酚蘭作指示染料，取50μl上樣；③電泳：電極緩沖液（有多種)，含1%SDS；④染色脫色：考馬斯亮蘭R-25m.quanxiangyun.cn/job/0染色，脫色；⑤制作標準分子量曲線；量取從原點到前沿溴酚蘭及原點至各條蛋白區(qū)域的距離。計算各自標準蛋白的Rf值，以LogMW對相應的Rf作圖，繪成標準分子量蛋白曲線如圖17-8、圖17-9所示，以待測蛋白質的Rf值在標準曲線上得到LgMW值，計算待測Apo純品的分子量。

測定分子量的SDS-PAGE法主要優(yōu)點是快速，樣品用量少，可同時測定幾個樣品。缺點是誤差較大，誤差主要與電泳蛋白區(qū)域移動距離測量是否有關。

SDS-PAGE法測定的是亞單位肽鏈的分子量。常用的標準蛋白質如表17-1所示。

表17-1 標準蛋白質及其分子量

六、雙相電泳

血漿或組織中有成千累萬種蛋白質，等電點近似，分子量大小類同的蛋白質很多，若僅單一測蛋白質的pI或分子量，還不足以說明是某一的蛋白質，可能是也可能不是。如果既測定pI，又測定分子量，利用這兩種參數(shù)鑒定蛋白，其確認的準確率將得到很大的提高，因為這兩種參數(shù)都相同的蛋白質的概率是很小的。為此常采用雙相電泳技術即第一相為IEF-PAGE，另一相為SDS-PAEG，進行蛋白質的鑒定。

七、蛋白質化學組成分析

末端氨基的分析，是鑒定蛋白質純度的方法之一。一條肽鏈的蛋白質，通過N-末端的定量分析，每克分子蛋白質應當有整數(shù)克分子的N-末端氨基酸，少量其他末端氨基酸的存在，常常表示存在有雜質。

分析蛋白質各種氨基酸百分比，也可作為蛋白質各類鑒定的參考值。

最終的純度標準，應當是氨基酸順序的測定。