免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn):第一節(jié)　免疫膠體金的制備

一、膠體金的特性和制備

（一)膠體金的結(jié)構(gòu)

膠體金（colloidalgold)也稱金溶膠（goldsol)，是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au)及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuC1₂^－)，外層離子層H⁺則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。

膠體金顆粒的基礎(chǔ)金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆�；�本是圓球形的，較大的膠體金顆粒（一般指大于30nm以上的)多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。

（二)膠體金的特性

1．膠體性質(zhì)膠體金顆粒大小多www.med126.com在1～100nm，微小金顆粒穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液。膠體金因而具有膠體的多種特性，特別是對(duì)電解質(zhì)的敏感性。電解質(zhì)能破壞膠體金顆粒的外周永水化層，從而打破膠體的穩(wěn)定狀態(tài)，使分散的單一金顆粒凝聚成大顆粒，而從液體中沉淀下來。某些蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)有保護(hù)膠體金、加強(qiáng)其穩(wěn)定性的作用。

2．呈色性微小顆粒膠體呈紅色，但不同大小的膠體呈色有一定的差別。最小的膠體金（2～5nm)是橙黃色的，中等大小的膠體金（10～20nm)是酒紅色的，較大顆粒的膠體金（30～80nm)則是紫紅色的。根據(jù)這一特點(diǎn)，用肉眼觀察膠體金的顏色可粗略估計(jì)金顆粒的大小。

3．光吸收性膠體金在可見光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，這個(gè)光吸收峰的波長(zhǎng)（λmax)在510～550nm范圍內(nèi)，隨膠體金顆粒大小而變化，大顆粒膠體金的λmax偏向長(zhǎng)波長(zhǎng)，反之，小顆粒膠體金的λmax則偏于短波長(zhǎng)，表19-1所列為部分膠體金的λmax。

（三)膠體金的制備

1．制備方法膠體金的制備多采用還原法。氯金酸（HauC1₄)是主要還原材料，常用還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。根據(jù)還原劑類型以及還原作用的強(qiáng)弱，可以制備0.8nm～150nm不等的膠體金。最常用的制備方法為檸檬酸鹽還原法。具體操作方法如下：

（1)將HauC1₄先配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸。

（2)攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入一定量的1％檸檬酸三鈉（Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液。

（3)繼續(xù)加熱煮沸15min。此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過程約2～3min。

（4)冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。

用此法可制備16～147nm粒徑的膠體金。金顆粒的大小取決于制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉的量。表19-1列舉制備4種不同粒徑膠體金時(shí)檸檬酸三鈉的用量。

表19-1 四種粒徑膠體金的制備及特性

*還原100ml0.01％HauC1₄所需量

2．注意事項(xiàng)

（1)氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。

（2)氯金酸對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時(shí)，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。

（3)用于制備膠體金的蒸餾水應(yīng)是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。

（4)是以制備膠體金的玻璃容器必須是絕對(duì)清潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。

（5)膠體金的鑒定和保存：膠體金的制備并不難，但要制好高質(zhì)量的膠體金卻也并非易事。因此對(duì)每次制好的膠體金應(yīng)加以檢定，主要檢查指標(biāo)有顆粒大小，粒徑的均一程度及有無凝集顆粒等。

肉眼觀察是最基本也是最簡(jiǎn)單和方便的檢定方法，但需要一定的經(jīng)驗(yàn)。良好的膠體金應(yīng)該是清亮透明的，若制備的膠體金混濁或液體表面有漂浮物，提示此次制備的膠體金有較多的凝集顆粒。在日光下仔細(xì)觀察比較膠體金的顏色，可以粗略估計(jì)制得的金顆粒的大小。當(dāng)然也可用分光光度計(jì)掃描λmax來估計(jì)金顆粒的粒徑。結(jié)制備的膠體金最好作電鏡觀察，并選一些代表性的作顯微攝影，可以比較精確地測(cè)定膠體金的平均粒徑。

膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長(zhǎng)時(shí)間保存，加入少許防腐劑（如0.02％NaN₃)可有利于保存。保存不當(dāng)時(shí)會(huì)有細(xì)菌生長(zhǎng)或有凝集顆粒形成。少量凝集顆粒并不影響以后膠體金的標(biāo)記，使用時(shí)為提高標(biāo)記效率可先低速離心去除凝集顆粒。

二、免疫金的特性和制備

（一)免疫金的特性

膠體金可以和蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)結(jié)合，在免疫組織化學(xué)技術(shù)中，習(xí)慣上將膠體金結(jié)合蛋白質(zhì)的復(fù)合物稱為金探針。用于免疫測(cè)定時(shí)膠體金多與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體)結(jié)合，這類膠體金結(jié)合物常稱為免疫金復(fù)合物，或簡(jiǎn)稱免疫金（immunogold)。

膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合的機(jī)制尚有十分清楚，一般認(rèn)為是物理吸附性的。膠體金顆粒帶有一層表面陰性電荷，與蛋白質(zhì)表面的陽性電荷通過靜電感應(yīng)相附。因此環(huán)境pH和離子強(qiáng)度是影響吸附的主要因素，其他如膠體金顆粒的大小、蛋白質(zhì)的分子量及蛋白質(zhì)濃度等也會(huì)影響蛋白質(zhì)的吸附。

（二)免疫金的制備

1．用0.2mol/LK₂CO₃或0.1mol/LHC1調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至選定值。原則上可選www.med126.com擇待標(biāo)記蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，也可略為偏堿。但通常最適反應(yīng)pH往往需經(jīng)多次試驗(yàn)才能確定。

在調(diào)節(jié)膠體金的pH值時(shí)應(yīng)注意，膠體金會(huì)阻塞pH計(jì)的電極，不可直接將電極插入膠體金溶液中，宜先用終濃度為0.15的聚乙二醇（PEG，20000)穩(wěn)定膠體金后，再膠體金的pH值。

2．將1/10體積的合適濃度的蛋白質(zhì)溶液加于膠體金溶液中，放置室溫反應(yīng)2～5min。

由于鹽類成分能影響膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，并可使膠體金聚沉，因此待標(biāo)記蛋白質(zhì)溶液若含有較高的離子濃度，應(yīng)在標(biāo)記前先對(duì)低離子強(qiáng)度的蒸餾水透析去鹽。

3．加入濃度為0.2％的PEG或BSA以飽和游離的膠體金。

4．離心分離，去除上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心條件視膠體金顆粒的粒徑而異：對(duì)5nm金顆�？蛇x用40000r/min離心1h；8nm金顆粒用25000r/min離心45min；14nm金顆粒用25000r/min離心30min，40nm金顆粒用15000r/min離心30min。

5．輕吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的緩沖液懸浮，恢復(fù)原體積后再離心。如此洗滌2～4次。以徹底除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。

6．免疫金復(fù)合物最終用稀釋液配制成工作濃度保存。稀釋液通常是加入穩(wěn)定劑的緩沖液。緩沖溶液常用中性的PBS或Tris緩沖液。

多種蛋白質(zhì)、葡聚糖、PEG2000、明膠等均為良好的高分子穩(wěn)定劑，PEG和BSA是最常用的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑有兩大作用：一為保護(hù)膠體金的穩(wěn)定性，使之便于長(zhǎng)期保存；二為防止或減少免疫金復(fù)合物的非特異性吸附反應(yīng)。穩(wěn)定劑的合理選擇是十分重要的，不適當(dāng)?shù)姆�(wěn)定劑有時(shí)也會(huì)導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。