實用免疫細胞與核酸:第三節(jié)　分子雜交

一、概述

前面已經(jīng)介紹了核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵（主要是氫鍵)的形成即出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，這是核酸分子雜交的基礎。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序（即某種程度的同源性)就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進行。由于DNA一般都以雙鏈形式存在，因此在進行分子雜交時，應先將雙鏈DNA分子解聚成為單鏈，這一過程稱為變性，一般通過加熱或提高pH值來實現(xiàn)。使單鏈聚合雙鏈的過程稱為退火或復性。用分子雜交進行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素或非同位素標記成為探針，再與另一種核酸單鏈進行分子雜交。

核酸雜交技術基本上是Hall等1961年的工作開始的，探針與靶序列在溶液中雜交，通過平衡密度梯度離心分離雜交體。該法很慢、費力且不精確，但它開拓了核酸雜交技術的研究。Bolton等1962年設計了第一種簡單的固相雜交方法，稱為DNA-瓊脂技術。變性DNA固定在瓊脂中，DNA不能復性，但能與其它互補核酸序列雜交。典型的反應是用放射性標記的短DAN或RNA分子與膠中DNA雜交過夜，然后將膠置于柱中進行漂洗，去除游離探針，在高溫、低鹽條件下將結合的探針洗脫，洗脫液的放射性與結合的探針量呈正比。該法尤其適用于過量探針的飽和雜交實驗。60年代末，Britten等設計了另一種分析細胞基因組的方法。該法是研究液相中DNA的復性以比較不同來源核酸的復雜度，典型的方法是：從不同生物體（細菌、酵母、魚和哺乳動物等)內分離DNA，用水壓器剪切成長約450核苷酸（nt)的片段。剪切的DNA液（含0.12mol/L磷酸鹽緩沖液或0.18mol/l Na+)，經(jīng)煮沸使dsDNA熱變性成ssDNA。然后冷至約60℃，在此溫度孵育過程中，測定溶液一定時間內的UV260nm的吸光度（減色效應)來監(jiān)測互補鏈的復性程度。通常該實驗可比較不同來源生物DNA的復性速率，并可建立序列復雜度與動力學復雜度間的關系。

60年代中期Nygaard 等的研究為應用標記DNA或RNA探針檢測固定在硝酸纖維素（NC)膜上的DNA序列奠定了基礎。如Brown等應用這一技術評估了爪蟾rRNA基因的拷貝數(shù)。RNA在代謝過程中被3H尿嘧啶標記，并在過量的情況下與膜上固定的基因組DNA雜交，繼而用RNase處理，消化非特異性結合的RNA。漂洗后計數(shù)以測定雜交探針的量。通過計算與已知量DNA雜交的RNA量即可評估rRNA基因數(shù)。由于當時缺乏特異探針，這種方法不能用于研究其它特異基因的表達，這些早期過量探針膜雜交試驗實際上是現(xiàn)代膜雜交實驗的基礎。

進入70年代早期，許多重要的發(fā)展促進了核酸雜交技術的進展。例如，對特異基因轉錄產(chǎn)物的分析和對動力學雜交實驗又有興趣。固相化的Poly U –Sepharose和寡（dT)-纖維素使人們能從總RNA中分離PolyA+ RNA。用mRNA的經(jīng)純化技術可從網(wǎng)織紅細胞總RNA中制備α-和β-珠蛋白mRNA混合物。這些珠蛋白mRNA首次被用于合成特異的探針以分析珠蛋白基因的表達。由于制備cDNA探針很繁瑣，所獲得cDNA的長度和純度也不穩(wěn)定。所以尋求新的探針來源是使分子雜交技術進一步推廣的基礎。

70年代末期到80年代早期，分子生物學技術有了突破性進展，限制性內切酶的發(fā)展和應用使分子克隆成為可能。各種載體系統(tǒng)的誕生，尤其是質粒和噬菌體DAN載體的構建，使特異性DNA探針的來源變得十分豐富。人們可以從基因組DNA文庫和cDNA文庫中獲得特定基因克隆，只需培養(yǎng)細菌，便可提取大量的探針DNA。迄今為止，已克隆和定性了許多特異DNA探針。

由于固相化學技術和核酸自動合成儀的誕生，現(xiàn)在可常規(guī)制備18～100個堿基的寡核苷酸探針。應用限制酶和Southern印跡技術，用數(shù)微克DNA就可分析特異基因。特異DNA或RNA序列的量和大小均可用Southern印跡和Northern印跡來測定，與以前的技術相比，大大提高了雜交水平和可信度。

盡管取得了上述重大進展，但分子雜交技術在臨床實用中仍存在不少問題，必須提高檢測單拷貝基因的敏感性，用非放射性物質代替放射性同位素標記探針以及簡化實驗操作和縮短雜交時間，這樣，就需要在以下三方面著手研究：第一，完善非放射性標記探針；第二，靶序列和探針的擴增以及信號的放大；第三，發(fā)展簡單的雜交方式，只有這樣，才能使DNA探針實驗做到簡便、快速、低廉和安全。

二、探針-靶反應

從化學和生物學意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應后檢測的合適標記物，并僅與特異靶分子反應。抗原-抗體、外源凝集素-碳水化合物、親和素-生物素、受體-配基（ligand)以及互補核酸間的雜交均屬于探針-靶分子反應。蛋白質探針（如抗體)與特異靶分子是通過混合力（疏水、離子和氫鍵)的作用在少數(shù)特異位點上的結合，而核酸探針與互補鏈的反應則是根據(jù)雜交體的長短不同，通過氫鍵在幾十、幾百甚至上千個位點上的結合。因為有機溶液可降低雜交體的穩(wěn)定性，所以，疏水反應對互補核酸鏈的結合也有一定的作用，但對其特異性影響甚微。

核苷酸經(jīng)某一原子、功能基團或長側鏈修飾后仍可能進行堿基配對，這取決于修飾的部位和修飾的性質。這一特性有助于理解非放射性核酸探針標記物的設計和125I與DNA探針的化學結合。能與核酸結合的單一原子有銀、溴和碘等，這些元素可與嘧啶（胸腺嘧啶除外)環(huán)的C-5位或嘌呤環(huán)的C-8位反應而不影響氫鍵的形成。溴亦可與胸腺嘧啶的C-6位結合。而胞嘧啶的C-4和腺嘌呤的N-6就不能被修飾，否則會影響堿基配對，盡管C的N-4位和A的N-6位參與了氫鍵形成，但它們也是標記位點。這是因為標記的探針每1kb只摻入10～30個修飾堿基，即僅4%～12%的單個堿基被修飾的類似物取代了。盡管摻入位點處的堿基配對較弱或不存在，但對整個雜交分子的穩(wěn)定性影響很小。防止氫鍵破壞的一種方法就是修飾探針，即探針克隆入M13載體中，只修飾載體區(qū)而不修飾插入片段。當用放射性同位素32P和35S標記核酸時，由于同位素是摻入核酸骨架的磷酸二脂鍵中，因此堿基未發(fā)生任何修飾。在5’端的磷酸基團上可進行化學修飾，這是標記寡核苷酸探針的有效方法。因為這種方法是在一個探針分子上標記一個檢測的基團，所以，對長的克隆探針不適用。

此外，還可利用修飾的堿基來增加雜交的穩(wěn)定性和特異性。2-氫基腺嘌呤可替代寡核苷酸探針中的腺嘌呤通過形成3個氫鍵以增加雜交體的穩(wěn)定性。另外，在G-C豐富的RNA探針中，可用次黃嘌呤代替鳥嘌呤以獲得特異的雜交。因為次黃嘌呤和鳥嘌呤間只形成2個氫鍵，有效地降低了雜交體的Tm值，這樣，Tm值與雜交溫度更接近，雜交的嚴格性就增加了，因此，也就增加了特異性。

很顯然，結合位點的不同和可檢測基團與檢測系統(tǒng)的不同，可派生出很多核酸探針標記方法。這是由核酸的化學結構和性質所決定的。只有在對核酸分子的探針-靶反應的化學本質有了深入了解之后，才能更好地理解后面的章　節(jié)　內容。

三、核酸探針的種類

基因探針根據(jù)標記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類，根據(jù)探針的核酸性質不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類，DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。下面分別介紹這幾種探針。

（一)DNA探針

DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針�，F(xiàn)已獲得DNA探針數(shù)量很多，有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細菌的毒力因子基因探針和人類Alu探針。這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術的發(fā)展和應用。以細菌為例，目前分子雜交技術用于細菌的分類和菌種鑒定比之G+C百分比值要準確的多，是細菌分類學的一個發(fā)展方向。加之分子雜交技術的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。細菌的基因組大小約5×106bp，約含3000個基因。各種細菌之間絕大部分DNA是相同的，要獲得某細菌特異的核酸探針，通常要采取建立細菌基因組DNA文庫的辦法，即將細菌DNA切成小片段后分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫。然后用多種其它菌種的DNA作探針來篩選，產(chǎn)生雜交信號的克隆被剔除，最后剩下的不與任何其它細菌雜交的克隆則可能含有該細菌特異性DNA片段。將此重組質粒標記后作探針進一步鑒定，亦可經(jīng)DNA序列分析鑒定其基因來源和功能。因此要得到一種特異性DNA探針，常常是比較繁瑣的。探針DNA克隆的篩選也可采用血清學方法，所不同的是所建DNA文庫為可表達性，克隆菌落或噬斑經(jīng)裂解后釋放出表達抗原，然后用來源細菌的多克隆抗血清篩選陽性克隆，所得到多個陽性克隆再經(jīng)其它細菌的抗血清篩選，最后只與本細菌抗血清反應的表達克隆即含有此細菌的特異性基因片段，它所編碼的蛋白是該菌種所特有的。用這種表達文庫篩選得到的顯然只是特定基因探針。

對于基因探針的克隆尚有更快捷的途徑。這也是許多重要蛋白質的編碼基因的克隆方法。該方法的第一步是分離純化蛋白質，然后測定該蛋白的氨基或羥基末端的部分氨基酸序列，然后根據(jù)這一序列合成一套寡核苷酸探針。用此探針在DNA文庫中篩選，陽性克隆即是目標蛋白的編碼基因。值得一提的是真核細胞和原核細胞DNA組織有所不同。真核基因中含有非編碼的內含子序列，而原核則沒有。因此，真核基因組DNA探針用于檢測基因表達時雜交效率要明顯低于cDNA探針。

DNA探針（包括cDNA探針)的主要優(yōu)點有下面三點：①這類探針多克隆在質粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。②DNA探針不易降解（相對RNA而言)，一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機引物法，PCR標記法等，能用于同位素和非同位素標記。

（二)cDNA探針

cDNA（complementary DNA)是指互補于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA經(jīng)一種稱為逆轉錄酶（reverse transcriptase)的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的，這種逆錄酶是Temin等在70年代初研究致癌RNA病毒時發(fā)現(xiàn)的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對)。這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱反向轉錄或逆轉錄。攜帶逆轉錄酶的病毒侵入宿主細胞后，病毒RNA在逆轉錄酶的催化下轉化成雙鏈cDNA，并進而整合人宿主細胞染色體DNA分子，隨宿主細胞DNA復制同時復制。這種整合的病毒基因組稱為原病毒。在靜止狀態(tài)下，可被復制多代，但不被表達，故無毒性。一旦因某種因素刺激而被活化，則該病毒大量復制，如其帶有癌基因，還可能誘發(fā)細胞癌變，后來發(fā)現(xiàn)逆轉錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中，而且哺乳動物的胚胎細胞和正在分裂的淋巴細胞也含有逆轉錄酶。逆轉錄酶的作用是以dNTP為底物，RNA為模板，tRNA（主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在Trna3’-OH末端上，5’－3’方向，合成與RNA互補的DNA單鏈，稱為互補DNA（cDNA)，單鏈cDNA與模板RNA形成RNA-DNA雜交體。隨后在逆轉錄酶的RNase H活性作用下，將RNA鏈水解成小片段。cDNA單鏈的3’末端回折形成一個小引物末端，逆轉錄酶又以第一條cDNA鏈為模板再合成第二第cDNA鏈，至此，完成逆轉錄全過程，合成雙鏈cDNA。

逆轉錄現(xiàn)在已成為一項重要的分子生物學技術，廣泛用于基因的克隆和表達。從逆轉錄病毒中提取的逆轉錄酶已商品化，最常用的有AMV逆轉錄酶。利用真核Mrna3’末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸（oligo(dT))用作引物，在逆轉錄酶催化下合成互補于mRNA的cRNA鏈，然后再用RNase H將mRNA消化掉，再加入大腸桿菌的DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈，即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉錄過程。

所得到的雙鏈cDNA分子經(jīng)S1核酸酶切平兩端后接一個有限制酶切點的接頭（linker)，再經(jīng)特定的限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與含互補末端的載體進行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA，如λgt，EMBL和Charon系列等。用這類載體可以得到包含104以上的轉化子的文庫，再經(jīng)前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術獲得的DNA探針不含有內含子序列。因此尤其適用于基因表達的檢測。

（三)RNA探針

RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應效率極高。早期采用的RNA探針是細胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細胞基因轉錄或病毒復制過程中得到標記的，標記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。例如，在篩選逆轉錄病毒人類免疫缺陷病毒（HIV)的基因組DNA克隆時，因無DNA探針可利用，就利用HIV的全套標記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。又如進行中的轉錄分析（nuclear run on transcrip－tion assay)時，在體外將細胞核分離出來，然后在α-32P-ATP的存在下進行轉錄，所合成mR－NA均摻入同位素而得到標記，此混合mRNA與固定于硝酸纖維素濾膜上的某一特定的基因的DNA進行雜交，便可反映出該基因的轉錄狀態(tài)，這是一種反向探針實驗技術。

近幾年體外轉錄技術不斷完善，已相繼建立了單向和雙向體外轉錄系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要基于一類新型載體pSP和pGEM，這類載體在多克隆位點兩側分別帶有SP6啟動子和T7啟動子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以進行RNA轉錄，如果在多克隆位點接頭中插入了外源DNA片段，則可以此DNA兩條鏈中的一條為模板轉錄生成RNA。這種體外轉錄反應效率很高，在1h內可合成近10μg的RNA產(chǎn)生，只要在底物中加入適量的放射性或生物素標記的NTP，則所合成的RNA可得到高效標記。該方法能有效地控制探針的長度并可提高標記物的利用率。

值得一提的是，通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉錄方向，即以哪條DNA鏈以模板轉錄RNA。這種可以得到同義RNA探針（與mRNA同序列)和反義RNA探針（與mRNA互補)，反義RNA又稱cRNA，除可用于反義核酸研究外，還可用于檢測mRNA的表達水平。在這種情況下，因為探針和靶序列均為單鏈，所以雜交的效率要比DNA-DNA雜交高幾個數(shù)量級。RNA探針除可用于檢測DNA和mRNA外，還有一個重要用途，在研究基因表達時，常常需要觀察該基因的轉錄狀況。在原核表達系統(tǒng)中外源基因不僅進行正向轉錄，有時還存在反向轉錄（即生成反義RNA)，這種現(xiàn)象往往是外源基因表達不高的重要原因。另外，在真核系統(tǒng)，某些基因也存在反向轉錄，產(chǎn)生反義RNA，參與自身表達的調控。在這些情況下，要準確測定正向和反向轉錄水平就不能用雙鏈DNA探針，而只能用RNA探針或單鏈DNA探針。

綜上所述，RNA探針和cRNA探針具有DNA探針所不能比擬的高雜交效率，但RNA探針也存在易于降解和標記方法復雜等缺點。

（四)寡核酸探針

前述三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首先進行克隆以便繪制酶譜和測序時，也常應用克隆。克隆探針一般較寡核苷酸探針特異性強，復雜度也高，從統(tǒng)計學角度而言，較長的序列隨機碰撞互補序列的機會較短序列少，克隆探針的另一優(yōu)點是，可獲得較強的雜交信號，因為克隆探針較寡核苷酸探針摻入的可檢測標記基因更多。但是，較長的探針對于靶序列變異的識別能力又有所降低。對于僅是單個堿基或少數(shù)堿基不同的兩序列，克隆探針不能區(qū)分，往往雜交信號相當。這既是其優(yōu)點，又是其缺點。優(yōu)點是當用于檢測病原微生物時，不會因病毒或細菌DNA的少許變異而漏診，缺點則是不能用于點突變的檢測。這種情況下，通常要采用化學合成的寡核苷酸探針。

合成的寡核苷酸探針具有一些獨特的優(yōu)點：①由于鏈短，其序列復雜度低，分子量小，所以和等量靶位點完全雜交的時間比克隆探針短，如20nt的寡核苷酸探針在濃度為100ng/ml，靶序列為1～100pg、1kb片段或3×10-18~3×10-16mol/L時，達到最大程度的雜交只需10min，而用2kb的克隆探針在同樣條件下達到完全雜交則需16h。②寡核苷酸探針可識別靶序列內1個堿基的變化，因為短探針中堿基的錯配能大幅度地降低雜交體的Tm值。③一次可大量合成寡核苷酸探針（1～10mg)，使得這種探針價格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學或化學方法修飾以進行非放射性標記物的標記。盡管克隆探針較特異，但通過細心篩選序列和/或選擇相對長的序列（＞30nt)亦可設計出非常特異的寡核苷酸探針。最常用的寡核苷酸探針有18～40個堿基，目前的合成儀可有效地合成至少50個堿基的探針。下面是篩選寡核苷酸針的一些原則。

①長18～50nt，較長探針雜交時間較長，合成量低；較短探針特異性會差些。

②堿基成分：G+C含量為40%～60%，超出此范圍則會增加非特異雜交。

③探針分子內不應存在互補區(qū)，否則會出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結構。

④避免單一堿基的重復出現(xiàn)（不能多于4個)，如-CCCCC-。

⑤一旦選定某一序更符合上述標準，最好將序列與核酸庫中核酸序列比較，探針序列應與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。

按上述原則選出的探針會增加成功的機會，選定后進行合成與標記，并摸索合適的雜交條件。方法是制備幾張點有特異靶DNA和不相關DNA的膜，各膜分別在不同溫度下與探針雜交，特異靶DNA雜交信號強而非特異DNA不產(chǎn)生任何雜交反應的就是最適雜交溫度。在進行點突變檢測雜交的反應時，洗膜條件和溫度物選擇往往更為重要。所選漂洗條件必需使野生型靶DNA與探針產(chǎn)生強的雜交信號而突變型靶DNA則不產(chǎn)生雜交信號，這可以通過逐漸提高洗膜溫度來完成。

寡核苷酸探針還有一個重要用途。在用于檢測單個堿基差異時尚可采用一種稱為寡核苷酸限制（oligonucleotide restriction)的技術。該技術只有在突變點位于某一限制性內切酶識別位點時才有效。例如，鐮刀狀紅細胞貧血是因β珠蛋白基因的第6個寡碼子由GAG變成GTG，從而導致所編碼氨基酸由酪氨酸變成纈氨酸。突變的β-珠蛋白功能異常，稱作S珠蛋白，而野生型稱為A珠蛋白，其基因型分別為βS和βA。恰好突變點A→T位于Del I的識別序列CT－NAG之內，這就為設計寡核苷酸限制實驗創(chuàng)造了條件。方法是合成一個長40個堿基的寡核苷酸探針，其5’末端距突變堿基有11個堿基，該探針與βA基因的非編碼鏈互補。將此探針的5’末端標記上32P。雜交方法采用液相雜交法，即在液相中將靶DNA變性解鏈，然后與探針退火，產(chǎn)生雜交體。如靶DNA為βA型，則兩條鏈完全互補，并產(chǎn)生Dde I的酶切位點；如待檢DNA為βS型，則所形成的雜交體中兩條鏈在突變堿基處不配對，從而不能被Del I所識別。用Del I消化雜交DNA，顯然βA會被切開而βS不被切開。βADNA雜交體被切開后，5’端探針序列因只有8個堿基，與雜交鏈結合不緊而解離，從而產(chǎn)生游離的5’端標記8核苷酸單鏈。不被切開的βS雜交體尚可被另一個限制酶Hinf I消化，該酶的識別位點緊靠Del I 識別位點上游。βS雜交DNA經(jīng)Hinf I消化后，將釋出探針DNA的5’末端3核苷酸小片段。βADNA雜交體因已無Hinf I識別序列，故而不能被Hinf I消化。這樣βA和βSDNA經(jīng)此寡核苷酸探針雜交和Del I及Hinf I消化后，分別產(chǎn)生游離的8核苷酸（8nt)和3核苷酸（3nt) 片段，它們可以經(jīng)電泳分離后進行放射自顯影而獲證實。藉此策略，可輕易將各種β珠蛋白突變型鑒別開，如純合野生型AA結果為僅有8nt片段，純合突變型SS則僅可檢出3nt片段，而雜合子AS型則兩種片段均存在。

四、核酸探針的標記和檢測（詳見每十九章　)

分子雜交是核酸鏈間堿基配對規(guī)則的一種結合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子雜交這一特性來對特定核酸序列進行檢測，必須將雜交鏈中的一條用某種可以檢測的分子進行標記，這條鏈就稱為核酸探針。因此，核酸探針的制備是分子雜交技術的關鍵。最早采用的也是目前最常用的核酸探針標記方法是放射性同位素標記。常用的放射性同位素有32P和35S前者能量高，信號強，最常用。放射性同位素標記探針雖然敏感度高，但卻存在輻射危害和半衰期限制（32P半衰期為14.3天，35S半衰期為87.1天，125I的半衰期為60天)，3H的半衰期長達12.3年，但它所釋放β放射線能量太低（0.018Mev)，只能用于組織原位雜交。由于同位素標記的探針在使用過程中存在著上述缺點，近些年來，人們在尋找非航船性標記物方面取得了很大進展，國際上已有多家公司相繼推出多種非放射性探針標記試劑盒，在國內也已具備生物素類標記物的生產(chǎn)能力，并有相應試劑出售。目前，非放射性標記物有下述幾類：金屬如Hg，熒光物質如FITC；半抗原如地高辛；生物素；酶類如辣根過氧化物酶（HRP)。半乳糖苷酶或堿性磷酸酶（AKP)等。不同的標記物，所標記探針的方法及檢測方法也各異。下面僅就國際上較常用的，有實用價值或發(fā)展前景的幾種核酸標記方法及其顯示方法分兩方面簡述如下。

（一)核酸探針的常用酶促標記技術

1．缺口平移　該技術由Kelly等于1970年創(chuàng)立。其原理是首先用DNA酶在雙鏈DNA探針分子的一條鏈上制造一些缺口（nick ),缺口處會形成3’—羥基末端，這時再在大腸桿菌DNA聚合酶I的催化下將核苷酸殘基加在3’－羥基上，www.med126.com同時，根據(jù)大腸桿菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶將缺口5’側核苷酸依次切除。其結果是在缺口平移（nick tr－anslation)。根據(jù)這個原理，如果用高強度的放射性核苷酸（通常為α-32PdATP)置換先前存在的核苷酸，則可制備比活性高達108cpm（每分鐘計數(shù))/μg的32P標記DNA。用缺口平移法標記的DNA探針能滿足大多數(shù)雜交要求。

2．DNA快速末端標記　大腸桿菌DNA聚合酶i 經(jīng)枯草桿菌蛋白酶切割可得到兩條多肽鏈，其中分子量為76kd的大片段稱為Klenow片段。該酶具有完整聚合酶I的5’→3’聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，但缺乏5’→3’核酸外切酶活性。利用Klenow片段可以填補由限制酶消解DNA所產(chǎn)生的3’凹陷末端。因此，用這種方法可以標記雙鏈DNA的凹陷3’末端。用Klenow片段標記末端一般只用一種[α-32P]dNTP，加入反應的[α-32P]dNTP取決于DNA末端延伸的5’末端序列，例如，用EcorI切割DNA所產(chǎn)生的末端用[α-32P]dNTP標記。標記反應可在一種限制酶消解DNA后立即進行，不需去除限制酶或使其失活，也不需更換緩沖液，具有3’延伸的DNA末端不能被Klenow片段有效在標記，欲標記這類分子可用T4DNA聚合酶。

選用這種標記方法是為了產(chǎn)生可用于凝膠電泳時作大小參照物的DNA片段。因為標記的DNA片段與其摩爾濃度成比例，而不與片段大小成比例，在限制酶消化物中，小的和大的片段都以相同程度被標記。因此，可使用放射自顯影術確定不有被溴化乙錠染色所觀察到的大小DNA帶，尤其適用于Southern吸印雜交時分子量標志物的標記。通過選擇相應標記的dNTP，該法還可以只標記DNA分子的一端。例如，若DNA片段的兩個末端分別是Bam H I和Hind III 粘膜端，在反應中只加入[α-32P]dNTP或[α-32P]dGTP，使可選擇性標記兩末端之一。

3．用T4多核苷酸激酶標記DNa 5’末端　寡核苷酸探針或短的RNA和DNA探針可選用此法標記，寡核苷酸探針一般多用這種標記。T4多核苷酸激酶（polynucleotide kinase, PNK)是由T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷酸轉移至DNA或RNA的5’－OH末端。在過量ADP存在時，也可促進磷酸交換反應，使PNK將DNA末端5’磷酸轉移到ADP上生成ATP，然后催化[α-32P]dNTP上的標記磷酸轉移至DNA的5’末端，從而使DNA重新磷酸化，并藉此得到標記。顯然，PNK標記DNA末端需要[γ-32P]dNTP，這與前述酶促標記方法不同。通常，對于5’磷酸化的DNA探針，要先用堿性磷酸酶去掉磷酸基團，然后再用于PNK催化的5’末端標記，這樣標記效率較高。

4．隨機引物延伸　這是以單鏈DNA或RNA模板合成高比活性32P標記探針所選用的方法。原理是使長6～8nt的寡核苷酸片段與變性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I或反轉錄酶的作用下，以每一個退火到模板上的寡核苷酸片段為引物引發(fā)DNA鏈的合成，在反應時將[α-32P]dNTP摻入合成鏈，即得到標記。變性處理后，新合成鏈（探針片段)與模板解離，即得到無數(shù)各種大小的探針DNA。因為所用寡核苷酸片段很短，在低溫條件下可與模板DNA隨機發(fā)生退火反應，因此被稱為隨機引物（random primer)。這種隨機引物可用小牛胸腺DNA或魚精DNA制備。

用隨機引物法標記的DNA探針或cDNA探針比活性顯著高于缺口平移法，且結果較為穩(wěn)定。這種方法尤其適用于真核DNA探針，因為隨機引物來自真核DNA，其與真核序列的退火率要高于原核序列。因此，對于克隆的DAN探針，常先將插入探針DNA切下來回收后再標記，而缺口平移法可直接用于全質粒的標記。

5．聚合酶鏈反應（詳見第二十二章)　聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR)是一種分子生物學新技術，由美國Cetus公司人類遺傳學部的Kary.B. Mullis于1985年創(chuàng)立。該技術利用兩個與相反鏈雜交并隨著于靶DNA兩側的寡核苷酸引物經(jīng)酶促合成特異的DNA片段，包括模板變性，引物退火和引物延伸三個步驟的反復循環(huán)，最終兩引物所夾靶DNA得到千萬倍以上的擴增。因此，PCR技術已成為一項極為有價值的技術并已迅速推廣應用。

PCR技術有許多重要用途，其中之一便是可用來標記高比活性DNA探針。PCR技術具有很高的特異性，可在1～2h之內在量合成探針DNA片段，如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它標記的dNTP，則探針DNA合成過程中可得到很好的標記，標記物的摻入率可高達70%～80%。因此，PCR標記技術特別適用于大規(guī)模檢測和非放射性標記。該法的缺點是要合成一對特異性PCR引物。使用從探針DNA上制備的小片段作引物也能取得較好的標記效果。

（二)核酸探針的非放射性標記技術

1．光敏生物素標記核酸　目前使用的光標生物素試劑有兩種：光生物素（乙酸鹽)和補骨脂素生物素。它們都是由一個光敏基團、一個連接臂和一個生物素基團組成。光生物素的光敏基團是-N3，它在光作用下可與核酸中的堿基結合。補骨脂素生物素中的光敏基團補骨脂素在光照（320～400μm)下，可與單鏈或雙鏈核酸發(fā)生反應，反應主要在T上，C上也有一定程度的反應。光敏生物素的連接臂含6～12個碳原子，用以減少探針雜交時的空間位阻。光敏生物素標記核酸，方法簡單，靈敏度也可達到pg水平，可用于外源基因的檢測。最近出現(xiàn)了一種新的光敏活性DNA生物素試劑，即生物素-聚乙二醇-當歸素（BPA)。BPA的DNA結合部分是一個活性糖香豆素衍生物，在長波UV下它可與DNA堿基共價鍵結合。BPA反應物與DNA結合比光敏生物素更特異，在可見光下它不與核酸反應，這個特性可使BPA只標記粗制細胞裂解物中的核酸，而不標記蛋白、多糖和其他細胞大分子。

2．酶促生物素標記核酸　以生物素化的脫氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio –7 – dATP、Bio-11-dCTP)等代替相應32P標記的脫氧核苷三磷酸，經(jīng)DNA聚合酶作用摻入DNA。Bio-dUTP代替dTTP,Bio-dATP代替dATP，Bio- dCTP代替dCTP。Bio –11-dUTP的11是指生物素基團與脫氧核苷酸之間連接臂的碳鏈長度。常用的酶促生物素標記DNA的方法有缺口平移法和隨機引物延伸法。

3．寡核苷酸的生物素末端標記　有5’-磷酸的化學標記法和3’-OH的酶促標記法。前者將寡核苷酸的5’-磷酸接上一個乙二胺，然后用琥珀酰亞胺生物素，將生物素基團連接在磷酸酰胺基上。后者是用末端轉移將Bio-11–dUTP加于其3’-OH端（脫去一個焦磷酸)。

4．酶標DNA　標記試劑是辣根過氧化酶（HRP)或堿性磷酸酶（AP)。通過對苯醌（PBQ)與聚乙烯亞胺（PEI)連接而成（HRP-PBQ-PEI+)，此試劑在戊二醛的作用下與變性的DNA結合，使HRP與DNA連接在一起，組成HRP標記的DNA探針。

5．酶標寡核苷酸　包括核苷酸5’末端標記HRP法和內部標記AP法。前者是在HRP中產(chǎn)生一個-HS反應基團，在寡核苷酸合成終了加在5’端，帶一個C6的-HS基，與活化的HRP反應生成5’-HRP寡核苷酸。后者是在全成寡核苷酸過程中將一個5’帶連接臂及CF3基團的尿苷3’亞磷酰亞胺合成在寡核苷酸鏈中，合成后此活化的寡核苷酸與AP反應即得到AP標記的寡核苷酸。

6．DNA半抗原標記　其原理與Bio-11-dTUP相同，只是用毛地黃甙代替生物素形成Dig –11- dUTP，酶促摻入DNA分子。用抗毛地黃甙抗體檢測標記在DNA上的半抗原分子Digoxigenin（地高辛)

(三)非放射性探針的顯示體系

1．AP顯色體系

BCI –OH+NBT→紫色↓

ASO：等位基因特異的寡核苷酸，BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸，NBT：四氮唑藍，Pi：磷酸。

2．HRP顯色體系

HRP + H2O2[HRP·H2O2]

ODA –NH2 +[HRP ·H2O2]棗→ODA-N = ODA/棕色↓+HRP +H2O

ODA：鄰-聯(lián)茴香胺。

3．ABC顯色體系

DNA –B+ SA – AP→DNa – B – SA或DNa – B +SA - BAP→DNa –B –SA –BAP

經(jīng)上述兩反應，把AP連接在DNA上以后，再進行AP酶顯色。這里SA為Streptavidin（鏈酶親合素)，BAP為生物素化的磷酸酶，B為生物素（biotin)，ABC為Avidin – Biotin - Enzyme com－plex, 即親合素- 生物素-酶復合物。

以上反應AP亦可用HRP代替。

表18-3曱核酸探針的標記分子

* ：NT：缺口平移； PCR：聚合酶鏈反應；RPL： 隨機引物標記； TL：末端標記

4．非放射發(fā)光自顯影若將AP或HRP的顯色底物根據(jù)光化學原理換成一種酶解后產(chǎn)生光子的化合物，可用自顯影技術暴光X線片顯示。

（1)HRP發(fā)光自顯影：氨基苯-甲酰肼在HRP與H2O2的作用下氧化為氨基苯二甲酸，同時放出N2及發(fā)光（波長428nm)。發(fā)光時加入某些酚的衍生物時可增強發(fā)光上千倍。反應如下圖：

（2)AP的發(fā)光自顯影：AP的發(fā)光底物是金剛烷二氧丁環(huán)磷酸鹽（AMPPD)，它含有磷酸酯鍵在AP的作用下水解下一個磷酸，進而由分子內過氧鍵提供能源分解產(chǎn)生金剛酮和激發(fā)態(tài)的甲基間-氧苯甲酸陰離子，當此陰離子恢復到基態(tài)時發(fā)出光子。可用波拉黑白片（621型)直接暴光顯影。顯影信號強度比BCIP/NBP顯色法強兩上數(shù)量級。是很前景的顯示體系。

其發(fā)光反應的原理如下：

HRP的發(fā)光原理：

AP的發(fā)光原理：

五、核酸分子雜交的類型

隨著基因工程研究技術的迅猛發(fā)展，新的核酸分子雜交類型和方法在不斷涌現(xiàn)和完善。核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應核酸游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。液相雜交所參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中。

由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我復性等優(yōu)點，故該法最為常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。

液相雜交是一種研究最早且操作復合的雜交類型，在過去的30年里雖有時被應用，但總不如固相雜交那樣普遍。其主要原因是雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。近幾年由于雜交檢測技術的不斷改進，商業(yè)性基因探針診斷盒的實際應用，推動了液相雜交技術的迅速發(fā)展。下面對固相雜交和液相雜交分別進行介紹。

（一)固相膜核酸分子雜交方法

固相核酸雜交多是在膜上進行，因此，以下主要介紹固相膜的核酸分子雜交方法：

1．DNA的變性　DNA變性解鏈是雜交成功的關鍵。Southern印跡雜交時DNA在凝膠中變性，變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/l NaCl和0.5mol/l NaOH中1h然后用數(shù)倍體積的1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和1.5mol/l NaCl溶液中和1h。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性，但強酸會使核酸降解。一般認為堿變性較好，可避免DNA降解。熱變性在要低DNA濃度（100μg/ml)和低鹽濃度（0.1mol/l SSC 含15mmol/l NaCl - 1.5mmol/L檸檬酸三鈉，pH7.0)下進行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml,加10mol/l NaOH使最終濃度為0.1mol/L（pH約12.8)，室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10min/l HCl或5mol/l NaH2PO4調pH到7～8[亦可用堿變性后，調至中性，再加熱100。c 10min]，DNA變懷可用OD260增加（約30%～40%)來檢測，變性DNA醇沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰浴保存。

2．變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定　硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45μm)先在蒸餾水中充分浸泡，再用6×SSC浸泡30min～2h，涼干。DNA樣品轉移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后在80。C真空干燥2h。

3．預雜交　濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米濾膜加0.2ml預熱至60。C的預雜交液（6×SSC，0.5%,SDS,5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚精DNA)。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調濃度至10mg/ml，用前放100。C水浴中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，可封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68。C水浴保溫3~12h。當預雜交液溫度升至68。C時，在濾膜表面常會形成小氣泡。輕輕晃動袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點對于保證濾膜表面充分浸潤預雜交液很重要。

4．雜交　從水浴中取出塑料袋，用剪刀剪開一角，盡可能擠凈預雜交液。用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好是足量的液體保持濾膜濕潤（50μl/cm2)。溶液的組成是6×SSC，0.01mol/l EDTA, 變性的標記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS, 100μg/ml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴密封口，雜交反應在68℃水浴中進行，所需時間視探針和檢測靶DNA的性質及探針的比活性等情況而定，一般4～20h。

5．洗膜　取出塑料袋，用剪刀剪開，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盤中，室溫下漂洗5min。再將濾膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中，室溫下洗滌15min（輕輕搖動)。然后將濾膜移入0.1×SSC和0.5%SDS溶液中；68℃輕輕搖動保溫2h，更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。

洗膜的溫度一般應控制在低于Tm值12℃以上。（Tm = 69.3 + 0.41x(G +C) %)。雙鏈DNA的Tm值隨錯配堿基對數(shù)每增加1%而遞減1℃。

6．結果顯示　非放射性檢測方法前已述及，此處主要介紹放射性測定方法。固相膜的放射性雜交結果顯示有兩種方式，一是放射性自顯影法，另一種是液閃計數(shù)法。前一種方法比較簡單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中曝光數(shù)小時至數(shù)天，再顯影、定影即可。對于雜交信號較弱的固相膜，用一塊增感屏可顯著增強曝光強度。此外，為了減弱32P的散射，曝光m.quanxiangyun.cn通常在-20℃或-80℃下進行。液閃計數(shù)法主要用于打點和狹縫雜交及為了比較兩個雜交信號的強弱等情形。方法是將完成雜交的膜在漂洗結束后剪成小塊（每份樣品1塊)，80℃真空干燥后裝閃爍瓶。加入2～5ml閃爍液，剪2～3塊無樣品膜塊作為本底對照。在液體閃爍計數(shù)器上自動計數(shù)。液體計數(shù)測定放射性強度也可在放射自顯影之后進行。

（二)固相核酸分子雜交類型

1．菌落原位雜交（Colonyin situ hybridization)　菌落原位雜交是將細菌從培養(yǎng)平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將NDA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。

實驗步驟如下：

①將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同。

②培養(yǎng)細菌至產(chǎn)生1～2mm大小的菌落。

③在一塊平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體。將帶有菌落的濾膜取下，輕輕置于濾紙上，菌落面上在，注意防止在濾膜底面存有氣泡。

④5min后，將濾膜轉至用變性溶液（0.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·NaCl)浸濕的濾紙上，放置10min。

⑤將濾膜轉至中和溶液（1.5mol/lNaCl , 0.5mol/L Tris·HCl ，pH8.0)浸濕的濾紙上，放置10min。重復中和1次。

⑥將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過的濾紙上，放置10min。SSPE配成20×貯備液：3.6mol/l NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4), 20mmol/L EDTA(pH7.4)。

⑦將濾膜用濾紙吸干，80℃真空烘干2h。

以下操作參考前述。

2．斑點雜交（Dot blot)斑點雜交法是將被檢標本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。為使點樣準確方便，市售有多種多管吸印儀（manifolds)，如Minifold I和II、Bio-Dot (Bio –Rad )和Hybri –Dot,它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀，反復沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。

（1)DAN斑點雜交

①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。

②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。

③用鉛筆在濾膜上標好位置，將DNA點樣于膜上。每個樣品一般點50μl（2～10μg DNA)。

④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（2)RNA斑點雜交：與上法類似，每個樣品至多加10μg總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化)。方法是將RNA溶于5μlDEPC水，加15μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含0.15mol/l甲醛)使RNA變性。然后取5～8μl點樣于處理好的濾膜上，烘干。

培養(yǎng)細胞，標本處理技術可以簡化，不用提取和純化RNA。方法是用含0.5%Nonidet P40的低滲緩沖液對多種動物細胞作簡單處理，離心去掉細胞核和細胞碎片，就得到基本不帶DNA而富含RNA的細胞質提取物，這一粗RNA在高鹽下用甲醛變性，不需加工直接點到硝酸纖維素膜上。本法可以快速檢測大量標本，而只需極少量的細胞（5×104)或組織。

整個RNA實驗中，要防止激活內源性RNase，有許多種預防措施，有一種是在樣品中加入核糖核苷氧礬基復合物（RVC)。

（3)完整細胞斑點雜交：應用類似檢測細菌菌落的方法，可以對細胞培養(yǎng)物的特異序列進行快速檢測。將整個細胞點到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養(yǎng)細胞中檢測到少至5pg 的Epstein– Barr病毒DNA。完整細胞斑點印跡法可以用于篩選大量標本，因為它是使細胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標記的探針雜交。但它不適于非放射性標記探針，因為DNA純度不夠，會產(chǎn)生高本底。

3．Southern印跡雜交（southern blot )Southern blot 是研究DNA圖譜的基本技術，在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值。Southern印跡雜交基本方法是將DNA標本用限制性內切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交，利用放射自顯影術確定探針互補的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

（1)瓊脂糖凝膠電泳：利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消化片段（0.3～25kb)分離開。分離大分子DNA片段（800～12000bp)用低濃度瓊脂糖（0.7%)，分離小分子片段（500～1000bp)用高濃度瓊脂糖（1.0%),300～5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠，根據(jù)分離樣品量、分離速度和分辨率要求的不同，可選用不同規(guī)格的電泳槽。

電泳時，同時將標記物加到旁邊孔中，便于確定樣品DNA的分子量。20伏恒壓電泳過夜。電泳畢，將膠浸到含0.5μg/ml EB的TBE緩沖液中染色30min，也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在配膠前加入膠中，在254nm短波透射燈下拍照，加橙黃色濾色鏡，使用高速一次成像膠片，光圈f4.5,曝光20～40s。

（2)硝酸纖維素濾膜吸印。

①將膠切成合適大小，切去右上角作為記號。

②將膠放進盛有變性緩沖液（1.5mol/lNaCl, 0.5mol/L NaOH)的盤中輕搖動15min。

③換到中和緩沖液（1mol/LTris·HCl , pH8.0, 1.5mol/L NaCl)中輕搖動30min。

④裁一張硝酸纖維素膜，2～4張3MM濾紙和一些吸印紙（可用衛(wèi)生紙)，都與膠的大小相同（硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大，否則易形成旁路)，先將硝酸纖維素膜浸到水中，再放入10×SSC中，接觸膠和硝酸纖維素膜時都要戴橡膠手套操作。

⑤平盤上放一塊比膠大的平板（盛膠槽翻過來即可)，上面鋪一張3MM濾紙，起燈芯作用，盤中加少量10×SSC緩沖液（2.5cm厚)，不能沒過平板，使3MM濾紙充分飽和。

⑥將膠倒扣到3MM濾紙上。

⑦浸濕的硝酸纖維素鋪在膠上，對齊，鋪膜時從一邊逐漸放下，防止產(chǎn)生氣泡，有氣泡時，可用吸管趕出，不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸。

⑧膜上放一張3MM濾紙，不能與膠接觸。

⑨上面加吸印紙及重物（500g左右)。

⑩通過濾紙的灶芯作用，平盤中的緩沖液就會通過膠上移，從而將DNA吸印到膜上，及時更換浸濕的吸印紙。在室溫下轉印過夜。

⑾去除上面的東西，用鑷了將膜取出，在6×SSC中洗一下（也可不洗)。

⑿自然干燥，80℃烤2h。

⒀這時的膜就可進行雜交，或室溫密封保存。

4．Northern印跡雜交（Northern blot)　這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術。RNA印跡技術正好與DNA相對應，故被趣稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為western blot。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進樣前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2’-羥基基團。RNA變性后有利于在轉印過程中與硝酸纖維素膜結合，它同樣可在高鹽中進行轉印，但在烘烤前與膜結合得并不牢固，所以在轉印后不能用低鹽緩沖液洗膜，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結合，為測定片段大小，可在同一塊膠上加標記物一同電泳，之后將標記物膠切下，上色、照像。樣品膠則進行Northern轉印，標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L 醋酸銨中10min，在水中就可脫色。在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。從瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mR－NA時，甲基氫氧化汞是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免RNase的污染。

下面介紹RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法：

（1)試劑

10×MSE緩沖液：0.2mol/L 嗎啉代丙烷磺酸（MOPS)，pH7.0, 50mmol/L 醋酸鈉，1mmol/l EDTA, pH8.0。

5×樣品緩沖液：50%甘油，1mmol/l EDTA, 0.4%溴酚藍。

甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L)。應在通風柜中操作，pH高于4.0。

去離子甲酰胺。

50mmol/L NaOH(含10mmol/l NaCl)。

0.1mol/L Tris·HCl,Ph7.5。

（2)步驟

①40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml 10×MSE緩沖液、11.5ml甲醛，加水定容 至70ml，混勻后 倒入盛膠槽。

②等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。

③使RNA變性（最多20μg)：RNa 4.5μl，10×MSE緩沖液2.0μl，甲醛3.5μl，去離子甲酰胺10.0μl。

④55℃加熱15min，冰浴冷卻。

⑤加2μl 5×載樣緩沖液。

⑥上樣，同時加RNA標記物。

⑦60伏電泳過夜。

⑧取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。

⑨室溫下將膠浸到50mmol/LNaOH和10mmol/l NaCl中45min，水解高分子RNA，以增強轉印。

⑩室溫下將膠浸到0.1mol/LTris·HCl (Ph7.5)中45min，使膠中和。

⑾20×SSC洗膠1h。

⑿20×SSC中過夜，轉印到硝酸纖維素膜上。

⒀取出硝酸纖維膜，80℃真空烘烤2h。

5．組織原位雜交（Tissuein situ hybridization)　組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細菌釋出DNA，然后進行雜交。而原位雜交是經(jīng)適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補序列在胞內的空間位置，這一點具有重要的生物學和病理學意義。例如，對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示特定的序列的位置；對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質內的功能排布；與細胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術。

用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。通常探針的長度以100～400nt為宜，過長則雜交效率減低。最近研究結果表明，寡核苷酸探針（16～30nt)能自由出入細菌和組織細胞壁，雜交效率明顯高于長探針。因此，寡核苷酸探針和不對稱PCR標記的小DNA探針或體外轉錄標記的RNA探針是組織原位雜交的優(yōu)選探針。

探針的標記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。放射性同位素中，3H和35S最為常用。3H標記的探針半衰期長，成像分辨率高，便于定位，缺點是能量低。35S標記探針活性較高，影像分辨率也較好。而32P能量過高，致使產(chǎn)生的影像模糊，不利于確定雜交位點。

原位雜交中，標本的固定條件是影響雜交效率的重要因素，標本組織蛋白質的消化程度對探針進入細胞極為重要。去除蛋白的方法是，用0.2mol/l HCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水，原位雜交還是一種新技術，發(fā)展很快，在敏感性、特異性和穩(wěn)定性上還需要進一步完善和提高（詳見二十章　)。

6．固相夾心雜交Dunn等最早介紹了夾心雜交類型，Ranki等又作了進一步的改進。夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個主要的優(yōu)點：①樣品不需要固定，對粗制樣品能做出可靠的檢測；②用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強，因為只有兩個雜交物都雜交才能產(chǎn)生可檢測的信號。

固相夾心雜交需要兩個靠近而不互相重疊的探針，一個作固相吸附探針，另一個作標記檢測探針。樣品基因組內核酸只有使這兩個探針緊密相連才能形成夾心結構。需注意的是兩個探針必須分別亞克隆進入兩個分離的非同源載體內，以避免產(chǎn)生高的本底信號（如一個克隆人Puc19,另一克隆人pBR322)。

夾心雜交法可用濾膜和小珠固定吸附探針，使用小珠可更好地進行標準化試驗和更容易對小量樣品進行操作。Dahlen 等利用微孔板進行夾心雜交，可同時進行大量樣品檢測，他們先吸取DNA探針加到凹板中，然后用紫外線照射使其固定到塑料板上。用微孔板進行夾心雜交還可直接用于PCR技術。應用光敏生物標記探針檢測PCR產(chǎn)物的敏感性和用32P標記探針（3×108cpm/μg)作16h放射自顯影的Southern雜交的敏感性一樣。用微孔板雜交的其它優(yōu)點還包括同時做多份樣品，加樣、漂洗和讀結果等步驟可以自動化。

7．其它雜交類型

（1)固化探針雜交：該法較少使用，原理是使未標記固化探針通過雜交與靶RNA或DNA結合，漂洗后，用酶標抗DNA：RNA抗體或抗DNA：DNA抗體與雜交物結合。將乳膠顆粒收集，吸附到膜上后漂洗，加入底物顯色并進行測定。探針濃度2μg/ml,80℃雜交，可在10～15min完成，檢測的敏感性為5×108靶序列。

（2)反向雜交：這個雜交類型是用標記的樣品核酸與未標記的固化探針DNA雜交，故稱為“反向雜交”。這種雜交方法的優(yōu)點是在一次雜交反應中，可同時檢測樣品中幾種核酸。這種雜交方式主要用于進行中的核酸轉錄試驗和多種病原微生物的檢測。前者是在轉錄過程中標記RNA探針，后者可用光敏生物素制劑BPA標記樣品核酸。

（三)固相膜核酸雜交的幾點說明

1．雜交膜的選用雜交膜是一種多孔、表面積很大的固相載體，核酸一旦固定在上面，就可用雜交法進行檢測。最常使用的膜是硝酸纖維素膜，用于放射性和非放射笥標記探針都很方便，產(chǎn)生的本底淺，與核酸結合的化學性質不是很清楚，推測為非共價鍵結合。經(jīng)80℃烤干2h和雜交處理后，核酸仍不會脫落。硝酸纖維素膜的另一特點是只與蛋白有微弱非特異結合，這在使用非同位素探針中尤為有用。硝酸纖維素膜的缺點是結合核酸能力的大小取決于轉印條件和高濃度鹽（＞10×SSC)，與小片段核酸（＜200bp)結合不牢，質地脆，不易操作。

尼龍膜在某些方面比硝酸纖維素膜好，它的強度大、耐用，可與小至10bp的片段共價結合。在低離子濃度緩沖液等多種條件下，它們都可與DNA單鏈或RNA緊密結合，且多數(shù)膜不需燒烤。尼龍膜韌性好，可反復處理與雜交，而不丟失被檢標本。它通過疏水鍵和離子鍵與核酸結合，結合力為350～500μg/cm2，比硝酸纖維素膜（80～100μg/cm2)強許多。尼龍膜的缺點是對蛋白有高親合力，不宜使用非同位素探針。

2．“噪音”的排除“噪音”（noise)是固相膜雜交方法常遇到的問題，指標記DNA結合到空白膜上的放射性計數(shù)，即本底。這個問題的克服一是使用高純度的核酸制品和充分嚴格的雜交條件：二是選擇合適的雜交反應液和對膜進行處理。研究發(fā)現(xiàn)，隨著離子強度的增加，空白膜（未固定DNA對照膜)上的“噪音”水平增加，而在50%甲酚胺6×SSC的雜交反應液中充分封閉膜上的多余非特異結合位點。

（四)液相核酸分子雜交類型

1．

（1)HAP吸附雜交：羥基磷灰石（HAP)層析或吸附是液相雜交中最早使用的方法。在液相中雜交后，DNA：DNA雜交雙鏈在低鹽條件可特異地吸附到HAP上。通過離心使吸附有核酸雙鏈的HAP沉淀，再用緩沖液離心漂洗幾次HAP，然后將HAP置于計數(shù)器上進行放射性計數(shù)。

（2)親合吸附雜交：生物素標記DNA探針與溶液中過量的靶RNA雜交，雜交物吸附到�；�親合素包被的固相支持物（如小球)上，用特異性抗DNA：RNA雜交物的酶標單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應，加入酶顯色底物，這個系統(tǒng)可快速（2h)檢測RNA。

（3)磁珠吸附雜交：Gen– probe公司最近應用吖啶翁酯（acridinium ester)標記DNA探針，這種試劑可用更敏感的化學發(fā)光來檢測。探針和靶雜交后，雜交物可特異地吸附在磁化的有孔小珠（陽離子磁化微球體上)。溶液中的磁性小珠可用磁鐵吸出，經(jīng)過簡單的漂洗步驟，吸附探針的小珠可用化學發(fā)光測定。

2．發(fā)光液相雜交

（1)能量傳遞法：Heller等設計用兩個緊接的探針，一個探針的一端用化學發(fā)光基團（供體)標記，另一個探針的一端用熒光物質標記，并且這兩個探針靠得很近。兩個靠得很近的探針用不同的物質標記（標記光發(fā)射)，當探針與特異的靶雜交后，這些標記物靠得很近。一種標記物發(fā)射的光被另一種標記物吸收，并重新發(fā)出不同波長的光，調節(jié)　檢測器使自動記錄第二次發(fā)射光的波長。只有在兩個探針分子靠得近時，才能產(chǎn)生受激發(fā)光，因此這種方法具有較好的特異性。

（2)吖啶翁酯標記法：吖啶翁酯標記探針與靶核酸雜交后，未雜交的標記探針分子上的吖啶翁酯可以用專門的方法選擇性除去，所以雜交探針的化學發(fā)光是與靶核酸的量成比例的。該法的缺點是檢測的敏感度低（約1ng的靶核酸)，僅適用于檢測擴增的靶序列，如rRNA或PCR擴增產(chǎn)物。

3．液相夾心雜交

（1)親合雜交：在靶核酸存在下，兩個探針與靶雜交，形成夾心結構，雜交完成后，雜交物可移到新的管或凹孔中，在其中雜交物上的吸附探針可結合到固相支持物上，而雜交物上的檢測探針可產(chǎn)生檢測信號。用生物素標記吸附探針，用¹²⁵I標記檢測探針，這個系統(tǒng)的敏感性可檢測出4×10⁶靶分子。該試驗保持了固相夾心雜交的高度特異性。

（2)采用多組合成探針和化學發(fā)光檢測：第一類探針是未標記的檢測探針和液相吸附探針，它們有50個堿基長，其中含有30個細菌特異序列堿基和20個堿基的單鏈長尾；第二類探針是固相吸附探針，它可吸附在小珠或微孔板上。未標記檢測探針的單鏈長尾用于結合擴增多個標記探針，液相吸附探針和靶雜交物從溶液中分離并固定在小珠或微板上，典型的試驗可用25個不同的檢測探針和10個不同的吸附探針。第一個標記檢測探針上附著很多酶（堿性磷酸酶或過氧化物酶)可實現(xiàn)未標記檢測探針的擴增。使用化學發(fā)光酶的底物比用顯色反應酶的底物更敏感。這個雜交方法已用于乙肝病毒、沙眼衣原體、淋球菌以及質�？剐缘臋z測，敏感性達到能檢測5×10⁴雙鏈DNA分子。

4．復性速率液相分子雜交這個方法的原理是細菌等原核生物的基因組DNA通常不包含重復順序。它們在液相中復性（雜交)時，同源DNA比異源DNA的復性速度要快。同源程度越高，復性速率和雜交率越快。利用這個特點，可以通過分光光度計直接測定變性DNA在一定條件下的復性速率，進而用理論推導的數(shù)學公式來計算DNA-DNA之間的雜交（結合)度。

六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化

（一)探針的選擇

根據(jù)不同的雜交實驗要求，應選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測靶序列上的單個堿基改變時應選用寡核苷酸探針，在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的DNA單鏈探針（通過克隆人M13噬菌體DNA獲得)或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交，因為它不易透過細胞膜進入胞內或核內。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標記探針（80～150bp)具有較大的優(yōu)越性。

在選用探針時經(jīng)常會受到可利用探針種類的限制。如在建立DNA文庫時，手頭沒有篩選特定基因的克隆探針，這時就可用寡核苷酸探針來代替。但必須首先純化該基因的編碼蛋白，并測定6個以上的末端氨基酸序列，通過反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探針。如果已有其它動物的同種基因克隆，因為人類和動物間在同一基因的核苷酸順序上存在較高的同源性，因此可利用已鑒定的動物基因作探針來篩選人類基因克隆。對于基因核苷酸序列背景清楚而無法獲得克隆探針時，可采用PCR方法擴增某段基因序列，并克隆人合適的質粒載體中，即可得到自己的探針。這種方法十分簡便，無論基因組DNA探針還是cDNA探針都可以容易地獲得，而且，可以建立PCR的基因檢測方法，與探針雜交方法可作對比，可謂一舉兩得。

（二)探針的標記方法

在選擇探針類型的同時，還需要選擇標記方法。探針的標記方法很多，選擇什么標記方法主要視個人的習慣和可利用條件而定。但在選擇標記方法時，還應考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。放射性探針的實際靈敏度不依賴于所采用的標記方法，如隨機引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。在檢測單拷貝基因序列時，應選用標記效率高、顯示靈敏的探針標記方法。在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)。

（三)探針的濃度

總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內，隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經(jīng)驗，要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中³²P標記探針與非放射性標記探針的用量分別為5～10ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無論應用何種標記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標記物的固相支持物的非特異結合特性的影響。

（四)雜交率

傳統(tǒng)雜交率分析主要用于DNA復性研究，在這種情況下，探針和靶鏈在溶液中的濃度相同�，F(xiàn)代雜交實驗無論在液相雜交還是固相雜交均在探針過剩的條件下進行，此外，固相雜交中靶序列不在液相，故其濃度不能精確計算。因此，本文不討論通常用于雜交反應的傳統(tǒng)二級速率公式，而敘述一級動力學公式。

在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度（復雜度)和探針濃度。下面列出的公式適用于過剩單鏈探針對靶序列雜交的情形，雙鏈探針開始時（1～4h)，雜交動力學相同，但長時間雜交后，由于探針本身的復性，可用于雜交的探針濃度會逐漸降低。公式（1)可用于估計半數(shù)探針與固定靶序列雜交所需的時間。

t_1/2=ln2/kc

t=保溫（雜交)時間（s)；k =形成雜交體的速率常數(shù)[mol/(Lxntxs)]；c =溶液中的探針濃度（mol/L)。速率常數(shù)K決定于探針長度（L)、探針復雜度（N)、溫度、離子強度、粘度和pH。不含重復序列的探針，l =N。例如，對一個含兩個20nt序列的40mer探針而言，l=40，N=20。K與這些變量的關系為：

Kn= 3.5×10⁵K=KnL0.5/N (2)

Kn是締結常數(shù)，Kn =3.5×10⁵。Na⁺濃度為0.4～1.0mol/L, Ph5～9和雜交溫度低于探針-靶序列雜交體Tm值2.5℃時，公式（1)和（2)可合并為（3)，用于計算半數(shù)探針與靶序列的雜交率（以秒計)。

對一個長500個堿基的探針而言，此值為：

長500個堿基的探針雜交時間很長（20h)，應用短探針和使用雜交促進劑有其優(yōu)越性。由于實際應用的探針長度變化較大（對＞1kb的探針，因擴散與粘度效應不可能使因素L得到合適的補償)。另外，固靶序列也不可能都用于雜交，所以，由公式預計的隨探針長度增加的雜交率不一定總是正確的。

（五)雜交最適溫度

雜交技術最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應溫度。若反應溫度低于Tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。若反應溫度再低（Tm-30℃)，雖然互補鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗，即最適復性溫度、苛刻復性溫度及非苛刻復性溫度。溫度的選擇及溫度對雜交的影響見表18-3。最適復性溫度（Optimunm renaturationtemperature, TOR)：Tor =Tm –25℃

苛刻復性溫度：Ts = Tm – (10或15℃)

非苛刻復性溫度：Tns =Tm – (30或35℃)

在2×SSC反應液中，可以根據(jù)下列公式計算最適復性溫度：TOr =0.51 (G+C%)+47℃。

表18-4 DNA—DNA雜交溫度的選擇范圍（2×SSC)

可以看出DNA復性和DNa–RNA, DNA-DNA雜交通常要在高溫反應條件下進行,其反應的最大速度是在低于Tm值約25℃。然而對于那些反應時間需要延長,或對生物活性必須保護的復雜生物的核酸研究(如哺乳動物),核酸長時間處于高溫下很顯然是不利的。這會引起核酸鏈的斷裂、膠嘌呤的作用，結合到膜上的DNA脫落也會增多。這個問題可以通過使用高濃度鹽溶液（如6.2mol/l NaCl)，或使用某些有機溶劑的水溶液降低反應溫度來解決。常使用的有機溶劑有兩類，甲酰胺和二甲亞砜（DMSO)。在雜交液中加入30%二甲亞砜可使T2噬菌體DNA的Tm值比原先降低14℃，而使用酰胺甚至可使DNA在室溫下變性和復性。Mc-Conaughy等發(fā)現(xiàn)，反應液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72℃。

現(xiàn)在認為，適當選擇甲酰胺和鹽水濃度及合適的反應溫度，可使DNA復性和DNA-RNA雜交獲得高特異性和更快的反應速度。

（六)雜交的嚴格性

影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴格性。一般認為在低于雜交體Tm值25℃時雜交最佳，所以首先要根據(jù)公式（4)計算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調節(jié)　鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。對用20個堿基以上的探針做DNA：DNA雜交的Tm值計算如下：

n =雜交體中最短鏈的長度，因此，對一個G+C為42%的500個堿基探針于5×SSC（0.75mol/l Na⁺)和50%甲酰胺雜交的Tm 值為：

T=81.5 +(-2.07)+ 17.22 –1 –(30.5)=65℃

T雜交 =65℃–25℃=40℃

影響TM值的其它因素：

（1)對克隆或合成探針而言，同源性每下降1%，Tm值就降低1.5℃，15～50個堿基的寡核苷酸探針的這種作用更明顯。

（2)RNA：DNA雜交體的Tm值較同樣的DNA：DNA雜交體的高10～15℃。

（3)RNA：RNA雜交體的Tm值較同樣的DNA：DNA雜交體的高20～25℃。

顯然，當用RNA為靶序列時，要使用甲酰胺來降低Tm 值以保證合適的雜交溫度。當以克隆的探針進行膜雜交時，在最后的漂洗步驟中應達到最嚴格的條件。對一個500個堿基探針而言，典型最終漂洗條件點0.1×SSC（0.015mol/l Na⁺),55℃。代入公式（4)可得：

Tm =81.5 (-30.3) +17.22 –1-0 =67℃

67℃-55℃=12℃

因此，較Tm低12℃的漂洗條件比Tm 低25℃的雜交相比條件更嚴格了。

對寡核苷核探針而言，雜交溫度往往低于Tm5℃，因此，對一個G+C為50%的30nt寡核苷酸探針來說，Tm 值為：

T雜交=55℃-5℃=50℃

下面一個經(jīng)典的公式適用于14-20個堿基的寡核苷酸探針：

Tm =4℃（g + C) +2℃（a + T)

在實際應用中，寡核苷酸探針的最佳雜交溫度必須精確確定。最方便的一種方法是制備一張含不同稀釋度靶DNA和非特異靶DNA（如魚精或大腸桿菌DNA)的膜。在不同溫度下使膜與探針雜交，特異靶序列結合探針信號很強，而非特異靶序列與探針無任何反應的溫度就是最適溫度，在某些條件下，可用二甲亞砜（DMSO)代替甲酰胺來降低Tm值。

用一個以上的探針的（如夾心雜交)雜交系統(tǒng)中，估計Tm值更加復雜�？捎蒙鲜龉�式估計每一探針的Tm 值。然后求其均值作為雜交溫度。

（七)雜交反應時間

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應不完成；時間長了也無益，會引起非特異結合增多。一般雜交反應要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co)和反應時間（t)的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應基本完成。Cot=0，基本上沒有 雜交。例如在液相雜交中未標記的DNa 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為9.6)，如果反應時間為21h，那么對于未標記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8, 雜交完成了。對標記Dn A（濃度為0.1μg/ml)來說Cot值為0.05，這就充分排除了標記DNA的自我復性。

（八)雜交促進劑

惰性多聚體可用來促進250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標記的探針可增加高達100倍。而短探針不需用促進劑，因其復雜度低和分子量小，短探針本身的雜交率就高。

硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500000。另一種常見的促進劑是聚乙二醇（PEG)，PEG分子量�。�6000～8000)、粘度低、價格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進劑時有必要優(yōu)化條件。另一種多聚體促進劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2%～4%。與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點是價格低廉，粘度低（MW=90000)。

小分子化學試劑酚和硫氰酸胍也能促進雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復性技術，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應用也是有限的。而硫氰酸胍可通過降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進RNA的雜交，有裂解細胞而抑制RNase的作用。總之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前最常用的雜交促進劑。