若想得到理想的ICC染色結(jié)果、正確地判斷抗原物質(zhì)在組織細胞內(nèi)的位置，除需有良好酶和抗體外，保持組織細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的不動性（Immobility)和免疫活性也是至關重要的。換言之，如果抗原物質(zhì)在組織細胞間彌散、丟失或失去免疫活性，無論如何努力染色都是徒勞的，所以說固定是ICC染色中非常重要的一環(huán)。ICC與其它組織學技術不同，除要求保存良好的結(jié)構(gòu)外，還需保存組織抗原的免疫活性。一般認為，新鮮組織能夠最大限度地保存組織抗原的免疫活性，但結(jié)構(gòu)較差，易出現(xiàn)抗原彌散丟失現(xiàn)象。Cumming（1980)報告，不固定的組織切片ICC染色時，環(huán)鳥苷酸含量丟失80%以上。固定的目的是使構(gòu)成組織細胞成分的蛋白等物質(zhì)不溶于水和有機溶劑，并迅速使組織細胞中各種酶降解、失活，防止組織自溶和抗原彌散，保持組織細胞的完整性和所要檢測物質(zhì)的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的關鍵一步。用于ICC的固定劑種類較多，選擇時應根據(jù)所要檢測物質(zhì)的抗原性質(zhì)和切片方法以及所用抗體特征等做最佳篩選。制片及固定方法見第一章 ，下面介紹兩種近年報道的新方法。
1．AMEX（Acetone Meth Enzoate Xylene )法是改良的冰凍置換法（freeze substitution)的簡稱，主要用于石蠟包埋標本。Sato(1986)報告，該法具有同新鮮（未固定)組織冰凍切片同樣的抗原保持性和石蠟切片的良好組織結(jié)構(gòu)保存。其機制為：組織在丙酮中固定（脫水)，組織細胞內(nèi)水份逐漸被丙酮取代，繼之，用苯甲酸酯取代組織內(nèi)丙酮，經(jīng)二甲苯置換后，石蠟包埋。組織在-20℃丙酮內(nèi)過夜亦形成冰晶，所以原方法將組織先置4℃丙酮20～30min，再移入-20℃丙酮過夜。實際上組織在4℃丙酮內(nèi)過夜亦可得到同樣效果。如在該固定液內(nèi)加入少量蛋白酶活性阻斷劑，并采用低溶點石蠟包埋等，可獲得更佳染色結(jié)果。
2．微波固定（Microwave fixation)為近幾年所注目的問題之一。該方法能保持良好的組織結(jié)構(gòu)和抗原性，適于各種切片的酶組化、ICC以及免疫電鏡等材料固定。其固定機理可能與微波（頻率1000～3000MHz)具有被水分吸收的性質(zhì)（通常所用的微波是頻率2450MHz，波長12cm)；生物材料含有大量水份，照射后，溫度升高，分子運動加快，促進固定液向組織內(nèi)滲透，加速與組織成分的反應，短時間內(nèi)達到固定的效果等有關。經(jīng)微波照射固定的組織，需置相同固定液中，繼續(xù)固定2～6h，室溫。
近年研究的專門固定用的微波爐已商品化，例如：Bio-Rad H2500型、日新EM·MWE-2等，該類微波爐能夠準確地調(diào)節(jié) 照射時間和測定被照材料的瞬時溫度。利用家庭微波爐代替時，應選用能以秒為單位調(diào)控的微波爐。實驗材料不同，所需固定液的量、照射時間等各異，所以應在預實驗的基礎上，找出合適的固定液量、照射時間和溫度。多數(shù)實驗室的條件為：固定液5～10m.quanxiangyun.cn/zhuyuan/ml，照射10～30s，照射后固定液的溫度≤50。C。其方法為：將實驗標本置于微波爐旋轉(zhuǎn)臺的中央，周邊放一燒杯盛300～500ml純水，吸收照射時爐內(nèi)產(chǎn)生的熱量，選擇強擋照射10～30s 。接通電源（on)至微波產(chǎn)生利用超聲波代替微波照射，或二者并用，照射后，組織標本和固定液的溫度升高較少，亦能獲得短時間內(nèi)良好的固定效果（Yasuda 1992)。
光鏡ICC染色，常用的有冰凍切片和石蠟切片兩種，二者各有其優(yōu)缺點，應根據(jù)抗原的性質(zhì)、實驗室條件，合理選擇之。對未知抗原顯示時，最好同時應用。冰凍切片為ICC研究所首選。
Shi（1991)等報告：微波爐照射的切片，能夠激活部分核內(nèi)抗原活性。其機制不清，可能與高溫、高熱的作用，使核內(nèi)DNA雙鏈解開，DNA、RNA解離，抗原暴露有關。其步驟為：將切片脫蠟水洗后，置染色瓶中，加入去離子水或緩沖液至瓶頸處，反復多次照射，每次1min，照射5～10次，每次照射后，補充瓶中蒸發(fā)掉的液體，照射溫度不超過90～95℃為宜。此處理后，細胞核染色以蘇木精為佳（詳見第一章 )。
