四、HRP標(biāo)記凝集素及凝集素抗體的制備
1．HRP標(biāo)記凝集素法 適用于小量的凝集素標(biāo)記（Ponder 1983)。
（1)HRP的活化
�、賹�10mg HRP(Sigma Type VI)溶解在1ml 0.3mol/L 的重碳酸鈉溶液中（1.25g/50ml)。
�、诩�50μl含1%氟二硝基苯的無水乙醇溶液，室溫輕度攪拌1h。
�、奂�1ml含0.06mol/L的過碘酸鈉的蒸餾水（0.62g/50ml)，室溫下輕度攪拌30min。
�、茉谑覝叵录觾傻�0.16mol/L乙二醇，輕攪1h。
�、萦肧ephadex G—25裝成小柱，用0.3mol/L的重碳酸鈉溶液，使含HRP的混合液過柱。
�。�2)結(jié)合
①正常條件下，可用凝集素及過氧化物酶各半量，但其比例可根據(jù)需要調(diào)整，以10mg凝集素溶解在25ml的重碳酸鹽緩沖液里，加到“活化”的HRP中去 ，這樣得出的凝集素濃度大約是0.3mg/ml，可加進(jìn)0.1mol/L相應(yīng)的特異的糖，以保護(hù)凝集素結(jié)合時的結(jié)合部位。糖在下步透析或?qū)游鰰r去掉。
�、谠谑覝叵螺p攪拌，結(jié)合3h。
�、奂尤�1mg硼氫化鈉，室溫下作用1h以穩(wěn)定結(jié)合物活性。
�、苡�1N HCl調(diào)整pH至6.4，留置室溫下過夜。
�。�3)純化
�、儆眠m當(dāng)?shù)哪z層析柱如Sephadex G—200、Saphacryl—300層析法將游離的凝集素、游離的過氧化物酶和高分子量的成分從結(jié)合物分離出去，包括抑制性的糖也在此時分離出去。
�、谔峒兒蟮慕Y(jié)合物在280nm和403nm波長處測量其吸光率。用1%BSA先通過0.22μm的微孔過濾器，以確定被結(jié)合的凝集素是否被吸附在濾器中，然后上述結(jié)合物經(jīng)過該微孔濾過器過濾到一個無菌瓶中。
�、奂尤氙B氮鈉，濃度1：1000，保存于4℃C備用。
2．抗凝集素抗體的制備 抗凝集素抗體的制備法與一般免疫血清制備大致相同（見第二章 )。所不同的是：①凝集素具有較強(qiáng)的毒性，易使被免疫動物發(fā)病或甚至死亡。解決的方法是經(jīng)處理使凝集素變性，從而減低其毒性，但同時要保證其抗原性不受或少受破壞。②要設(shè)法阻斷凝集素的糖結(jié)合部位，以減少對這些部位的抗體的產(chǎn)生，解決的辦法是預(yù)先以相應(yīng)的糖阻斷這些結(jié)合部位。Leathem 和Atkin（1982)設(shè)計了一個辦法，他們首先應(yīng)用瓊脂糖（Sepharose)珠，珠上有一系列共價糖的附著，這些糖可阻斷凝集素結(jié)合部位，這種糖珠有商品供應(yīng)（Sigma LtD)，每1ml糖珠能結(jié)合大約12mg凝集素。其次用加入福爾馬林和加熱的方法使凝集素變性，毒性減低而不影響抗原性。具體操作如下：
�、�1ml瓊脂糖—半乳糖珠與1mg花生凝集素相結(jié)合，室溫1h。
�、诩尤�10ml 10%福爾馬林，在水浴中加熱到60℃，1h。
�、塾名}水離心洗珠，將珠分成以10μl為單位的若干小份，保存在-20℃。
�、芷は露嗵幾⑸鋬芍患彝帽巢浚看巫⑸�100μl，每隔三周注射一次。取血40～50ml，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/P>
