ICC染色結(jié)果判斷與其它組織化學(xué)相似，應(yīng)在熟悉所應(yīng)用方法、抗體的優(yōu)點和局限性的基礎(chǔ)上，避免主觀意識，進(jìn)行客觀判斷。一般認(rèn)為在嚴(yán)格操作、控制染色的條件，選擇特異性抗體等條件下，所得結(jié)果是陽性時才有積極意義。而陰性時，不一定意味著該物質(zhì)或抗原不存在，即不能排除實驗過程所致的抗原丟失或抗體選擇不當(dāng)?shù)纫鹑斯ぜ傧�。另外根�?jù)ICC染色強(qiáng)弱做半定量分析時，必須是同時固定、相同的組織塊、相鄰/同一切片，在嚴(yán)格控制抗體用量和顯色時間等條件下，進(jìn)行圖象測定，否則無法相互比較。鏡檢時，首先從對照標(biāo)本開始，判斷固定是否合適、非特異性著色強(qiáng)弱等再從低倍至高倍順序觀察實驗標(biāo)本，預(yù)期陽性部位是否被染色，不該含此類物質(zhì)的部位是否陰性等。一般認(rèn)為，切片邊緣的較強(qiáng)染色，屬于非特異性著色，所以應(yīng)避免作為陽性結(jié)果的依據(jù)。同時應(yīng)結(jié)合對照實驗、鑒別假陽性，以便做出正確判斷。
一、對照實驗
1．吸收實驗 應(yīng)用尚無文獻(xiàn)報告的抗血清/自己制備的抗血清進(jìn)行ICC染色時，需用相應(yīng)的抗原吸收抗血清后，再孵育標(biāo)本，判斷結(jié)果的可信性（結(jié)果應(yīng)為陰性)。常用的吸收實驗分固相吸收和液相吸收兩種（見本書第一章 )，對于不能形成沉淀，難以用離心沉降法分離的一些小分子多肽類抗原，以固相吸收為佳。一般市售抗體均經(jīng)特異性檢測，所以應(yīng)用購買抗體時可省略此步。
2．交叉實驗 我們知道，引起機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的并非是免疫原整個分子，而是其中的一部份—抗原決定簇。每個抗原可能有不同的抗原決定簇，不同的抗原亦可能有類似的抗原決定簇，因此一種抗血清可能與幾種抗原結(jié)合。所以同時最好亦用結(jié)構(gòu)相近的抗原做吸收實驗，以避免抗原間的交叉反應(yīng)。
3．替代實驗 用制備第一抗體相同種屬的正常血清（1/10或相同IgG濃度)替代第一抗體或用第二抗體相同種屬的正常血清替代酶標(biāo)抗體/橋抗體或省略其中任何一種免疫試劑或酶等，以PBS代替之，分別孵育切片，結(jié)果均應(yīng)為陰性。
4．置換實驗 應(yīng)用無關(guān)的特異性抗體代替第一抗體，孵育切片，結(jié)果應(yīng)陰性。如果同時進(jìn)行幾種特異性抗體的ICC染色時，彼此之間即為此類對照。例如，無關(guān)的數(shù)種抗體，均在相同部位出現(xiàn)類似陽性結(jié)果時，非特異性著色的可能性較大，應(yīng)慎重判斷。
5．陽性對照 不具有ICC染色經(jīng)驗者，從事此項工作時，最好同時染色已知陽性標(biāo)本，以排除操作過程失誤所致的染色陰性。陽性標(biāo)本切片最好冰凍保存?zhèn)溆谩?/P>
另外，在觀察新的組織抗原時，最好同時比較不同的固定的組織標(biāo)本、冰凍切處及石蠟切片的ICC染色，選擇最佳條件，以期得到良好的實驗結(jié)果。
二、假陽性及其處理
組織成分與各種染色試劑及抗血清之間的非特異性結(jié)合稱假陽性，其主要原因和處理方法如下：
1．組織細(xì)胞內(nèi)色素 與DAB沉淀物顏色類似的色素，例如黑質(zhì)內(nèi)的神經(jīng)黑色素，不易與反應(yīng)產(chǎn)物區(qū)別開來�？捎闷渌娮庸w或免疫熒光技術(shù)鑒別之，亦可改用ALP代替HRP，進(jìn)行染色。醫(yī).學(xué).全.在.線.網(wǎng).站.提供
2．假過氧化物酶活性 RBC內(nèi)的血紅素輔基有類過氧化物酶活性，當(dāng)組織內(nèi)存在紅細(xì)胞時，即使不加過氧化酶，亦可出現(xiàn)陽性染色。用甲醇-0.3%H2O2孵育標(biāo)本15～20min（室溫)，能抑制這種假陽性。甲醇可以使血紅素蛋白中的（亞鐵)血紅素游離，后者被H2O2破壞，從而抑制類過氧化物酶的活性。一般認(rèn)為，RBC的染色容易同其它組織細(xì)胞區(qū)別，且動物實驗還可通過灌注沖洗組織內(nèi)的RBC，所以此步往往被省略。
3．內(nèi)源性過氧化物酶活性 粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等存在內(nèi)源性過氧化物酶，能夠與DAB-H2O2反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性，所以含此類細(xì)胞較豐富的脾臟、肝臟、骨髓等組織，ICC染色時，最好做內(nèi)源性酶阻斷。適當(dāng)?shù)墓潭�、�?jīng)酸酒精孵育15～20min，或1%乙酸-甲醇硝基鐵氰化物處理，冰凍切片可用苯肼孵育15～20min，均能不同程度地抑制內(nèi)源性酶的活性。近年Li(1987)報告，應(yīng)用0.1%NaN3 0.3%-- H2O2孵10～15min（室溫)能較好地抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性，冰凍切片效果尤佳。嗜酸性粒細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶活性較強(qiáng)，上述各種處理后，仍殘留部分活性，此種情況，在DAB-H2O2顯色液中加入終濃度為0.05NaN3,基本上可達(dá)到完全阻斷的作用。但是，各種封閉內(nèi)源性（假)過氧化物酶方法均不同程度地破壞組織的抗原性，所以在不影響反應(yīng)結(jié)果判斷或能夠同內(nèi)源性酶的反應(yīng)所致的假陽性區(qū)別時，盡量避免此類處理或改用ALP代替HRP進(jìn)行ICC染色，也可以在用第一抗體與抗原反應(yīng)結(jié)合后，再進(jìn)行消除內(nèi)源酶的處理。
4．游離醛基 醛類固定的組織切片上，可能存在些游離醛基，后者能與蛋白質(zhì)（含IgG)間非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽性，用白蛋白或封閉性阻斷等預(yù)先孵育切片，可封閉之。
5．疏水鍵和離子鍵 免疫球蛋白可通過疏水鍵或離子鍵與組織中的堿性蛋白或Fc受體（冰凍切片F(xiàn)c受體保存尤佳)非特異性結(jié)合。用正常血清（制備第二抗體種屬的血清為首選)，于第一抗體前孵育切片，可消除之�！�4”和“5”重疊應(yīng)用，更有利于降低背景染色。
6．天然抗體及不純抗體 天然抗體是指因動物自然感染等原因血清中存在的部分抗體：不純抗體是指在制備血清時，所用的抗原不純，獲得的抗體含有雜質(zhì)抗體。當(dāng)天然抗體或不純抗體與組織成分結(jié)合時，可引起非特異性染色。上述二者的含量均較低，增加第一抗體的稀釋度，可以降低其非特異性染色。
7．載體蛋白抗體 制備小分子多肽（分子量小于4kD)的抗體時，需借助載體蛋白，使小分子多肽獲得免疫原性，刺激動物產(chǎn)生特異性抗體。因載體本身具有抗原性，故動物同時也產(chǎn)生抗載體蛋白抗體，與組織蛋白結(jié)合后，引起背景染色。用固相吸收技術(shù)，能將載體蛋白抗體除去。一般市售抗體，均經(jīng)特異性檢測，所以“6”和“7”可不必考慮。
