衛(wèi)生毒理學(xué)-實驗指導(dǎo):實驗四 小鼠精子畸形試驗
衛(wèi)生毒理學(xué):實驗指導(dǎo) 實驗四 小鼠精子畸形試驗:◎<一 目的>◎<二 原理>◎<三 儀器及試劑>◎<四 實驗步驟>◎<五 統(tǒng)計方法及結(jié)果判定>※<一 目的>掌握小鼠精子畸形試驗的基本技術(shù) 返回頂部※<二 原理> 小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遺傳性，許多常染色體及X、Y性染色體基因直接或間接地決定精子形態(tài)。精子的畸形主要是指形態(tài)的異常，已知精子的畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果。因此形態(tài)的改變提示有關(guān)基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的改變。小鼠精※<一 目的>
返回頂部 ※<二 原理>
| 小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遺傳性，許多常染色體及X、Y性染色體基因直接或間接地決定精子形態(tài)。精子的畸形主要是指形態(tài)的異常，已知精子的畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果。因此形態(tài)的改變提示有關(guān)基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的改變。小鼠精子畸形試驗可檢測環(huán)境因子對精子生成、發(fā)育的影響，而且對已知的生殖細(xì)胞致突變物有高度敏感性，故本試驗可用作檢測環(huán)境因子在體內(nèi)對生殖細(xì)胞的致突變作用。 |
返回頂部 ※<三 儀器及試劑>
全部試劑除注明外，均為分析純，試驗用水為蒸餾水。
3.1 實驗室常用設(shè)備。
3.2 生物顯微鏡。
3.3 甲醇。
3.4 1%～2%伊紅染色液：稱取伊紅1～2g，溶于100mL蒸餾水備用。 |
返回頂部 ※<四 實驗步驟>
4.1 動物
6～8周齡(體重25～35g)。
4.2 劑量分組
設(shè)一個陰性對照(溶劑)組，一個陽性對照組及三個試驗組，每組至少有5只存活動物。陽性物可采用環(huán)磷酸胺40～60mg/(kg·d)或甲基磺酸甲酯(MMS)50mg/(kg·d)，絲裂霉素C(MMC)1.0～1.5mg/（kg·d)。最高劑量可取最大耐受量，或分別取1/2、1/4和1/8LD50作為劑量組。經(jīng)口給予，連續(xù)5d。
4.3 操作步驟
4.3.1 動物處死時間：各種會計資格致突變物作用于精子的不同發(fā)育階段，可在接觸某種致突變物后不同時間出現(xiàn)精子畸形，故有條件時，可給于受試物后第一、四、十周處死動物，檢查精子形態(tài)。因為大部分化學(xué)致突變物對精原細(xì)胞后期或初級精母m.quanxiangyun.cn/hushi/細(xì)胞早期的生殖細(xì)胞較為敏感，故一般均是于首次給受試物后的第35d處死。
4.3.2 用頸椎脫臼法處死小鼠，取出二側(cè)副睪，放入盛有適量生理鹽水(1mL)的小燒杯中或放入盛有2mL生理鹽水的平皿中。用眼科剪將副睪縱向剪1～2刀，靜止3～5min，輕輕搖動。用四層擦鏡紙或合成纖維血網(wǎng)袋過濾，吸濾液涂片�？諝飧稍锖�，用甲醇固定5min以上干燥。用1%～2%伊紅染色1h，用水輕沖，干燥。
4.3.3 鏡檢：在低倍鏡下(用綠色濾光片)找到背景清晰精子重疊較少的部位，用高倍鏡順序檢查精子形態(tài)，計數(shù)結(jié)構(gòu)完整精子。精子有頭無尾(輪廓不清)或頭部與其他精子或碎片重疊，或明顯是人為剪碎者，均不計算，每只動物至少檢查1000個精子。
精子畸形，主要表現(xiàn)在頭部，其次為尾部，畸形類型可分為無鉤、香蕉形、胖頭、無定形、尾折疊、雙頭、雙尾等。異常精子均應(yīng)記錄顯微鏡的坐標(biāo)數(shù)，以備查詢。并分別記錄異常類型，以便統(tǒng)計精子畸形率及精子畸形類型的構(gòu)成比。
判斷雙頭、雙尾畸形時，要注意與二條精子的部分重疊相鑒別，判斷無定形時要與人為剪碎及折疊相鑒別。 |
返回頂部 ※<五 統(tǒng)計方法及結(jié)果判定>
每個劑量組應(yīng)分別與相應(yīng)的陰性對照組進(jìn)行參數(shù)統(tǒng)計方法比較，如用Wilcoson秩和檢驗法評價精子畸形陽性的標(biāo)準(zhǔn)是，畸形率至少為陰性對照組的倍量或經(jīng)統(tǒng)計有顯著意義，并有劑量反應(yīng)關(guān)系。
一般陰性對照組的精子異常率為0.8%～3.4%，供參考。但應(yīng)有本實驗室所用實驗動物的自發(fā)畸形率作參考。 |
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