實(shí)驗(yàn)二十一 螺旋體
螺旋體(spirochete)是一類細(xì)長柔韌、彎曲呈螺旋狀、具有軸絲、運(yùn)動活潑的原核細(xì)胞型微生物。用革蘭染色法染色時不易著色。螺旋體種類多，除鉤端螺旋體(簡稱鉤體)外皆不易在人工培養(yǎng)基上生長。大多數(shù)為非致病性螺旋體，僅少數(shù)對人和動物有致病性。對人類致病的主要有鉤體(圖21-1)、梅毒螺旋體(圖21-2)、回歸熱螺旋體(圖21-3)和伯氏疏螺旋體。
圖21-1 鉤端螺旋體屬鏡下形態(tài)(暗視野) 圖21-2 梅毒螺旋體鏡下形態(tài)(暗視野)
圖21-3 回歸熱螺旋體鏡下形態(tài)(Giemsa染色)
一、鉤端螺旋體
（一)形態(tài)觀察
【材料與方法】
鉤體暗視野顯微鏡觀察 取鉤體培養(yǎng)液，滴于載玻片上，覆以蓋玻片。在暗視野顯微鏡聚光器上加1滴香柏油，使載玻片背面與油接觸，低倍鏡下調(diào)動反光鏡，使光集中在聚光器上，調(diào)清楚視野再換高倍鏡觀察。
【結(jié)果】
1．藥品數(shù)據(jù)在黑色背景中可清楚地見到閃爍光亮的螺旋體，一端或兩端彎曲呈鉤狀，運(yùn)動活潑。
2．鍍銀染色深，鉤體染成棕色，菌體粗，有鉤，細(xì)密螺旋不明顯。
（二)人工培養(yǎng)
鉤體人工培養(yǎng)較容易，常用柯索夫(Korthof)培養(yǎng)基。在含10%～20%的兔血清培養(yǎng)基中生長良好。溫度以28℃左右為宜。一般pH7.2～7.4。需氧。
【材料與方法】
1．取發(fā)病1～7d內(nèi)患者血2～3ml。
2．接種于2～3支柯索夫液體培養(yǎng)基，接種時，血2～3滴/支，血量與培養(yǎng)液成1∶1～20為宜，置28℃培養(yǎng)。
3．從第3d起，每天或數(shù)天檢查1次。
【結(jié)果】
7～10d為鉤體繁殖高峰，鉤體生長良好者，液體呈霧狀渾濁，輕搖培養(yǎng)基,有絮狀物泛起。若培養(yǎng)1個月仍無鉤體生長則為陰性。
（三)凝集溶解試驗(yàn)
【原理】
凝集溶解試驗(yàn)即活抗原顯微鏡凝集溶解試驗(yàn)，是目前用得最多的鉤體血清學(xué)試驗(yàn)之一。鉤體與相應(yīng)抗體結(jié)合而發(fā)生凝集，抗體濃度高時，可使凝集又發(fā)生溶解，故名凝集溶解試驗(yàn)。本試驗(yàn)有型特異性和較高敏感性，可用于臨床診斷、鉤體血清型鑒定和流行病學(xué)調(diào)查。
【材料與方法】
1．在有機(jī)玻璃凹孔板上，2h后，將各孔分別取1滴于載玻片上，覆以蓋玻片，在暗視野顯微鏡下觀察鉤體凝集溶解情況(表21-1)。
表21-1 活抗原顯凝試驗(yàn)操作方法(定量法)(單位：ml)
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凹孔編號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
血清稀釋度 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 對照
稀釋血清量 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 鹽水0.1
抗原(鉤體培養(yǎng)物)0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
血清最終稀釋度1:1001:200 1:400 1:800 1:醫(yī)學(xué).全在線m.quanxiangyun.cn1600 1:3200 1:6400 1:128001:25600 1:51200 －
搖勻，置37℃2h
假定結(jié)果 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ ++ + － － －
【結(jié)果】
結(jié)果判斷如下：
++++ 幾乎全部鉤體溶解，呈團(tuán)塊狀或大小不等的殘片，間或有少數(shù)游離的鉤體存在。
+++ 約75％以上的鉤體凝集，呈塊狀或蜘蛛狀，約25%鉤體游離。
++ 約50％鉤體凝集，呈小蜘蛛狀，約50%鉤體游離。
+ 約25％鉤體凝集，75%鉤體游離。
- 全部鉤體正常，分散，無凝集。
能使抗原發(fā)生凝集溶解(++)的血清最高稀釋度作為血清抗體效價。病人單份血清效價超過l:400，或雙份血清的第2份較第1份有4倍以上增長者，有診斷意義。
二、梅毒的血清學(xué)試驗(yàn)
梅毒的血清學(xué)試驗(yàn)根據(jù)所用抗原不同可分兩類。第一類是非螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)，用正常牛心肌類脂作抗原，檢測非特異性的反應(yīng)素。這一類試驗(yàn)主要有以純心磷脂、卵磷脂為抗原的方法，即性病研究實(shí)驗(yàn)方法(VDRL)及其改良法即血清不加熱的反應(yīng)素試驗(yàn)(unheated serum reagin test，USR)和快速血漿反應(yīng)素紙片試驗(yàn)(rapidplasma reagin，RPR),有商品試劑供應(yīng)。USR、RPR法的特異性、敏感性較好，且簡便快速，容易在一般實(shí)驗(yàn)室推廣使用，故最常用于梅毒的普查、篩選，并作為梅毒感染的標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)診斷方法。第二類為螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)，是以死的或活的梅毒螺旋體或其成分為抗原檢測特異性的抗梅毒螺旋體抗體，即熒光螺旋抗體吸附(fluorescenttreponemal antibody-absorption。FTA-ABS)試驗(yàn)和螺旋體制動試驗(yàn)(treponemal immoblization test，TPI)。第二類試驗(yàn)雖然特異性、敏感性都高，但試驗(yàn)復(fù)雜，不易推廣，主要用于疑難病例的診斷和鑒別生物學(xué)假陽性。
（一)血清不加熱的反應(yīng)素試驗(yàn)(USR)
【原理】
一般認(rèn)為梅螺旋體感染后，機(jī)體組織被破壞而裂解出一種類脂成分，并與梅毒螺旋體蛋白質(zhì)結(jié)合成類脂蛋白復(fù)合物，刺激機(jī)體產(chǎn)生反應(yīng)素，這種反應(yīng)素可與牛心肌類脂發(fā)生反應(yīng)。
【材料】
1．抗原 USR試劑(商品試劑)，置3～10℃可保存6個月。
2．玻片 在玻片上用油漆畫直徑為14mm圓圈數(shù)個。
3．1ml注射器、平面針頭：45滴/ml。
4．待檢血清標(biāo)本，不必滅活。
【方法】
1．玻片定性試驗(yàn)
(1)取待檢血清0.05ml加在玻片圓圈內(nèi)。
(2)用1ml注射器加上專用針頭，吸取USR試劑后垂直加入，每份標(biāo)本1滴。
(3)手搖或震蕩器搖動玻片4min，每分鐘搖動180次左右，在3min內(nèi)觀察完畢�？扇庋壑苯佑^察或顯微鏡觀察。
2．玻片定量試驗(yàn) 將原血清作倍比稀釋，從1∶2至1∶64，按定性方法操作。
【結(jié)果】
++++～+++ 肉眼可見大的或較大的塊狀物。
++ 可見小塊狀物，懸液清亮。
+顯微鏡下為小塊狀物，均勻分布。
±顆粒不規(guī)則分布，或呈細(xì)小粗糙物。
-顆粒細(xì)小，分布均勻。
（二)快速血漿反應(yīng)素紙片試驗(yàn)(RPR)
本法是USR的改良法，除具備USR的優(yōu)點(diǎn)外，患者血清、血漿均可用于試驗(yàn)，由于RPR試劑中加入高純度的膠體炭，可與陽性血清發(fā)生黑色凝塊，所以不用顯微鏡就能準(zhǔn)確判斷結(jié)果。
【材料】
1．抗原 RPR試劑(商品試劑)。
2．RPR試驗(yàn)紙片 每張有12個圈。
3．待檢血清標(biāo)本或血漿標(biāo)本，不必滅活。
4．1ml注射器，平面針頭，60滴/ml。
5．轉(zhuǎn)動器平面轉(zhuǎn)動，100次/min，轉(zhuǎn)動所形成的圓圈直徑約2cm。
【方法】
1．血清定性試驗(yàn)
(1)吸取待檢血清或血漿0.05ml加在紙板圓圈中，并擴(kuò)展到整個圓圈。
(2)將RPR懸液搖勻，用注射器吸取后于每個標(biāo)本上加1滴。
(3)用轉(zhuǎn)動器或手轉(zhuǎn)動紙板8min，為防止蒸發(fā)，可在紙板上加蓋。
(4)立即在明亮的光線下用肉眼觀察結(jié)果。為了更好地區(qū)分弱陽性與陰性結(jié)果，將紙板傾斜與水平面成30°角，作順時針旋轉(zhuǎn)，使血清與抗原在圓圈內(nèi)轉(zhuǎn)動，可更清楚地觀察反應(yīng)，必要時可借助于放大鏡。
2．血清定量試驗(yàn) 定性試驗(yàn)陽性和弱陽性者，都必須做定量試驗(yàn)。方法是將血清用生理鹽水作對倍稀釋，從1∶2至1∶32按定性試驗(yàn)操作。若效價高于1∶32，則應(yīng)測1∶64、l∶128、1∶256稀釋度。以最高稀釋度達(dá)到陽性或弱陽性反應(yīng)作為效價。
【結(jié)果】
陽性反應(yīng)：可見中等或大凝集塊。
弱陽性反應(yīng)：可見小凝集塊。
陰性反應(yīng)：無塊狀物或極少數(shù)顆粒聚集成粗糙物。
【注意事項(xiàng)】
1．本試驗(yàn)在23℃～29℃室溫進(jìn)行，氣溫過低或過高都可能影響反應(yīng)性。試劑及待檢血清從冰箱取出后也應(yīng)在23℃～29℃處放置30min再做試驗(yàn)。
2．作為輔助診斷，試驗(yàn)結(jié)果必須結(jié)合臨床病史、體征、治療史和流行病學(xué)情況進(jìn)行綜合判斷。
3．應(yīng)排除某些疾病引起的生物學(xué)假陽性和技術(shù)性誤差引起的假陽性。生物學(xué)假陽性的效價一般不超過1∶8。
4．臨床應(yīng)用時應(yīng)設(shè)陰、陽性對照。
