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[Key words] Polysialic acid neural cell adhesion molecule; DNA methylation; Epigenetics; Synaptic plasticity
多聚唾液酸(PSA)是線形同聚物構成的多糖，其作用是通過神經細胞黏附分子(NCAM)介導。因此，描述PSA時，通常以PSA-NCAM的形式。PSA-NCAM在整個神經系統(tǒng)的發(fā)育過程中都有重要作用，如神經前體細胞的遷移[1]，神經細胞的分化，突觸的可塑性和空間記憶的形成[2]，軸突旁路的形成[3]。本研究通過在基因水平和蛋白水平對能催化PSA合成的兩種多聚唾液酸轉移酶- ST8SiaII(STX)和 ST8SiaIV(PST)研究發(fā)現(xiàn)，調控這兩種酶表達的基因轉錄起始區(qū)富含GC，而且還包含SP-1蛋白識別序列，同時這個識別序列也包含了CpG 序列[4]，甲基化能夠用來作為多聚唾液酸表達的基因外調控。
1 材料與方法
1.1 材料：組織基因組DNA提取試劑：QIAGEN公司(JP);細胞基因組DNA提取試劑：GENTRA 公司(USA);鼠抗 PSA-NCAM單克隆抗體：CHEMICON INTERNATIONAL，Inc(USA)。免疫純化的生物素連接的山羊抗鼠 IgG+IgM抗體：Pierce Biotechnology，Inc(USA)。18d的胚胎鼠(E18)和成年小鼠C57BL/6J(山犁大學醫(yī)學部動物研究中心)各50只，體重分別為100-250g。小鼠Neuron2A細胞株：山犁大學醫(yī)學部環(huán)境遺傳醫(yī)學教室。胎牛血清和dulbeccos modified eagles medium(DMEM)來自SIGMA公司。蛋白定量試劑盒：Dojindo Molecular Technologies，Inc(JP);WizardTM DNA clean-up System：promega 公司。其他試劑購自SIGMA公司。
1.2 方法
1.2.1 小鼠神經纖維母細胞瘤的細胞株-Neuro2A，細胞培養(yǎng)及神經細胞和神經膠質細胞的原代培養(yǎng)：小鼠成纖維母細胞瘤的細胞株-Neuro2A，細胞常規(guī)復蘇后,以104/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液含10%(v/v)胎牛血清和青霉素/鏈霉素(100μg/ml)的DMEM，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)24h后，加入終濃度為1mM的視黃酸(retinoic acid)，48h后觀察細胞的分化情況，細胞80%融合后傳代。再加入不同濃度的丙戊酸和甲硫氨酸，48h后收集細胞，提取蛋白。
1.2.2 神經細胞和神經膠質細胞的原代培養(yǎng)：取18d的胚胎鼠(C57BL/6J)大腦皮層細胞分別培養(yǎng)在神經細胞培養(yǎng)液和神經膠質細胞培養(yǎng)液，大約2周后，細胞呈現(xiàn)互相連接生長。分別收集神經細胞和神經膠質細胞，提取蛋白。
1.2.3 蛋白提取：分別收集Neuro2A，神經細胞和神經膠質細胞，冷PBS洗滌細胞3次，用預冷的細胞裂解液(1% Triton X-100和1%的蛋白酶抑制劑)100μl裂解細胞(5000rpm，5min)，超聲波使溶液均勻透明 ，考馬斯亮藍(lowry)法測定蛋白濃度醫(yī).學全.在.線網站m.quanxiangyun.cn。
1.2.4 DNA提�。悍蛛x成年鼠和胚胎鼠的大腦、小腦、基底核、海馬，加入Proteinase K，55℃過夜消化，苯酚—氯仿抽提，酒精沉淀，干燥， TE溶解，紫外分光光度儀測量DNA濃度。
分別收集Neuro2A，神經細胞和神經膠質細胞，冷PBS洗滌細胞5次，加入細胞裂解液，震蕩，再經過RNase A處理和蛋白沉淀，異丙醇抽提，酒精沉淀，TE溶解，紫外分光光度儀測量DNA濃度。
1.2.5 PSA合成的甲基化分析—甲基化特異性的PCR (methylation-specific PCR)：上述提取的DNA，經過亞硫酸鹽處理后作為模板進行PCR擴增反應，引物的設計圍繞SP-1蛋白結合位點(引物序列見表1)。采用甲基化特異性的PCR 檢測了STX和PST基因轉錄其始區(qū)是否發(fā)生甲基化[5]。
