| 公開(公告)號 | CN1872997A |
| 公開(公告)日 | 2006.12.06 |
| 申請(專利)號 | CN200510026344.0 |
| 申請日期 | 2005.06.01 |
| 專利名稱 | 人異體間質干細胞（攜帶治療基因)的大規(guī)模培養(yǎng)新工藝 |
| 主分類號 | C12N5/08(2006.01)I |
| 分類號 | C12N5/08(2006.01)I;C12N15/85(2006.01)I;C12N15/86(2006.01)I;C12N15/861(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I;A61P37/00(2006.01)I;A61P9/00(2006.01)I;A61P5/00(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 上海二醫(yī)新生基因科技有限公司 |
| 發(fā)明(設計)人 | 張云福;裘建英;董西銀 |
| 地址 | 201611上海市松江區(qū)車墩鎮(zhèn)車亭公路128號B-1/10 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | |
| 代理人 | |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權項 | 人異體間質干細胞(攜帶治療基因的種子細胞)在GMP條件下大規(guī)模培養(yǎng)新工藝，其創(chuàng)新性包括以下幾個重要生產工藝的改進和創(chuàng)新：發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)技術；無血清培養(yǎng)工藝；治療基因的轉染技術(質粒DNA、RNA分子、病毒載體和非病毒載體)；攜帶治療基因的間質干細胞的大量富集。具體生產工藝步驟如下： (1).人異體間質干細胞(攜帶治療基因)種子的來源和建立 取自引產胎兒的骨髓間質干細胞(選擇前應對抽取者母體做安全性要求的檢測如：HIV，乙肝，丙肝，梅毒，衣支原體，遺傳病，以及詳細地采集病史，排除不健康的諸多因素，證明鍵康和安全的引產兒)或胎盤，臍血，成體骨髓間質干細胞。攜帶治療基因的種子人異體間質干細胞的建立，分兩步進行：從原代細胞開始轉染治療基因，取已轉染治療基因的細胞作種子細胞進行傳代培養(yǎng)至5-8代左右細胞(細胞傳代培養(yǎng)中觀察到，第10代的細胞增殖能力最強，細胞繁殖最旺盛)，達到生產量后，收集細胞；從原代細胞開始傳代培養(yǎng)(不轉染治療基因)，傳代培養(yǎng)至5-8代左右細胞分別存入種子工作庫，備作大規(guī)模生產培養(yǎng)的工作種子。 (2).人異體間質干細胞的放大(生產化)培養(yǎng) 用50L的特殊專用發(fā)酵罐，將人異體間質干細胞工作細胞庫中的種子細胞復蘇、傳代，按25L的發(fā)酵培養(yǎng)用量，接種1.5×105/mL的接種量，接種人異體間質干細胞入罐，接種前先預熱發(fā)酵罐至37℃，用CO2校正和平衡培養(yǎng)基pH值。按間質干細胞的培養(yǎng)生長條件，采用無血清或血清的培養(yǎng)介質，進行間質干細胞發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)方法進行生產化擴增培養(yǎng)，為保持間質干細胞不分化，培養(yǎng)基中絕不能加入有促進間質干細胞分化潛能的細胞因子和細胞生長因子，只能加入使細胞保持在未分化狀態(tài)增殖的細胞因子和細胞生長因子。發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中的各項間質干細胞培養(yǎng)生長條件的參數(shù)，由發(fā)酵罐的計算機程控自控檢測。培養(yǎng)過程中程控所顯示的培養(yǎng)參數(shù)變化，應立即予以補充(特別是細胞培養(yǎng)生長過程中對介質的要求和代謝產物清除)必須及時給予滿足，使罐內的細胞生產在最佳狀況。細胞的懸浮培養(yǎng)過程中，攪拌的速度約100-300r/min，不得大于350r/min，葉輪的切片應光滑，不能有鋒尖的棱角在攪拌時損傷細胞。攪拌的目的是保持細胞均勻呈懸浮狀態(tài)生長，保持罐內立面的細胞均能得到所需的代謝物(如：氧，氨基酸，糖原，核酸等)和排除代謝的廢物，使細胞保持三維空間最佳生長狀態(tài)。當細胞增殖至罐內有效培養(yǎng)面積的80％時，進行下階段治療基因的轉染過程。 (3).人間質干細胞與治療基因載體共轉染培養(yǎng) 人間質干細胞作于載體的靶細胞在發(fā)酵罐中大量擴增培養(yǎng)，至罐內培養(yǎng)密度的80％左右，將目的基因(質粒DNA、RNA分子、病毒載體和非病毒載體)加入發(fā)酵罐中進行基因轉染，如果是轉染質粒DNA或RNA分子，技術相對簡單，(轉染時加氯化鈣其它物質以增加細胞膜的通透性，使細胞膜空隙增大，易于吸入質粒DNA到細胞內)，但轉染率不高。用病毒載體進行轉染的過程比較復雜，特別是本發(fā)明著重推薦的腺相關病毒載體(rAAV)進行轉染。值得一提的是間質干細胞在發(fā)酵罐中培養(yǎng)的基本條件，應盡量提供與體內生活條件相接近的培養(yǎng)環(huán)境，培養(yǎng)環(huán)境至少包括以下幾個因素：所有與細胞接觸的設備，器材，溶液等，其中包括種子庫細胞培養(yǎng)和放大培養(yǎng)及生產過程，都必須保持絕對無菌，避免細胞受微生物的污染；必須要有充足的營養(yǎng)供應，絕對不能含有有害物質，甚至極微量有害離子；保證有適量的氧氣供應；及時清除細胞代謝產生的有害物質；有良好的適于細胞生存的外界環(huán)境，包括滲透壓，離子密度，氨基酸濃度，氧分壓，二氧化碳分壓，葡萄糖濃度，pH值，氨濃度等，以及保持合適的細胞密度。 (4).人間質干細胞(攜帶治療基因)的收集 間質干細胞經目的基因(質粒DNA、RNA分子、病毒載體或非病毒載體)轉染后，利用反應器(發(fā)酵罐)的濾膜排放系統(tǒng)將培養(yǎng)混合液濾放掉，排放去占發(fā)酵罐總體積約90％的培養(yǎng)液，留下大約5L的細胞混合液，在洗脫液的洗脫下，將細胞和洗脫液一起經過離心或過濾，收集沉淀的細胞層；等測試細胞凍存制品的安全性和細胞生物活性后，分別罐裝入西林瓶中，貼上標簽，再存入液氮中保存，分裝時的細胞(攜帶治療基因)加入適量的冰凍保護液以保證細胞在冰凍中不易破壞，保持細胞的生物活性。在銷售到臨床使用整個過程也應做到液氮低溫運送條件，使產品在臨床使用時，始終保持最佳的生物活性。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種人異體間質干細胞被用于基因治療載體的商業(yè)化培養(yǎng)工藝，解決了人異體間質干細胞(攜帶治療基因)從實驗室制備到工業(yè)化生產過程中的一系列難題，特別是采用發(fā)酵罐和轉瓶的生產工藝，使產量得到大幅提升，降低了生產成本，滿足了臨床商業(yè)化的要求；其次，是采用無血清生產工藝，克服和杜絕了動物血清對產品的污染問題。本發(fā)明的生產工藝過程包括：人異體間質干細胞(攜帶治療基因的種子細胞)的生產培養(yǎng)；治療基因的轉染和導入(質粒DNA、RNA分子、病毒載體如AV、AAV等以及非病毒載體)；細胞的收集和純化；安全性和生物活性檢測后包裝儲存。該生產工藝具有可控性和可操作性，保證了間質干細胞的生物活性，有很高的生產效益。 |
| 國際公布 |
