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公開(公告)號
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CN1772920A
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公開(公告)日
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2006.05.17
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申請(專利)號
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CN200510011086.9
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申請日期
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2005.10.27
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專利名稱
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快速、靈敏檢測甲肝減毒活疫苗病毒感染性滴度的方法
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主分類號
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C12Q1/68(2006.01)I
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分類號
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C12Q1/68(2006.01)I
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所
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發(fā)明(設(shè)計)人
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孫明波;蔣燕軍;廖國陽;李衛(wèi)東;周 健;姜述德
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地址
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650118云南省昆明市茭菱路379號
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頒證日
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國際申請
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機構(gòu)
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昆明正原專利代理有限責(zé)任公司
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代理人
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徐玲菊
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國省代碼
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云南;53
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主權(quán)項
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一種快速、靈敏檢測甲肝減毒活疫苗病毒感染性滴度的方法，其特征在于包括下列步驟： A、病毒培養(yǎng) 將KMB17細(xì)胞植入小方瓶中，培養(yǎng)至長成新鮮單層后，將甲肝減毒活疫苗樣品作10倍系列稀釋，取稀釋度為10-4-10-9的病毒液接種至該細(xì)胞單層上，吸附1～2小時后，補加維持液，于35-37℃培養(yǎng)5-8天； B、提取細(xì)胞內(nèi)甲肝病毒基因組正鏈RNA； C、引物設(shè)計 正向引物N1： 5’-TTGGGATTAGCGAGTATG-GGATGTTTCAGGAGTACAAGC-3’ 反向引物N2： 5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGAT-CTCTGATTGTTCTGTGACAGAC-3’ 正向引物M1：5’-TTGGGATTAGCGAGTATG-3’ 反向引物M2：5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGAT-3’ 正向引物N3：5’-ATTACAGGAGCAACTGATGTAG-3’； D、檢測甲肝病毒負(fù)鏈RNA中間體 (1)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 在離心管中依次加入下列試劑： 10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液2.5～5.0μl dNTP混合物(2.5～10mmol/L)1.25～10μl 正向引物N1(5～60μmol/L)1.0～5μl RNase抑制劑(40u/μl)1.0～2.0μl 逆轉(zhuǎn)錄酶(4u/μl)1.0～2.0μl 甲肝病毒RNA15.0～30.0μl 無核酸酶水補充至總反應(yīng)體積25～50μl 在37～42℃下反應(yīng)90～120分鐘；將所獲逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物煮沸45～75分鐘； (2)、第一輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 在離心管中依次加入下列試劑： 10×PCR緩沖液10.0～15.0μl dNTP混合物(2.5～10mmol/L)2.0～8.0μl 反向引物N2(5～60μmol/L)1.0～5.0μl 正向引物M1(5～60μmol/L)1.0～5.0μl DNA聚合酶(5u/μl)0.5～1.0μl 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物10.0～15.0μl 無核酸酶水補充至總反應(yīng)體積100～150μl 在94℃預(yù)熱20～30分鐘，之后在94℃變性1～2分鐘，在52～55℃退火1～2分鐘，在72℃延伸1.5～2分鐘，如此循環(huán)30～35次后，再在72℃延伸20分鐘，得第一輪聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng)產(chǎn)物； (3)、第二輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 在離心管中依次加入下列試劑： 10×PCR緩沖液5.0～7.5μl dNTP混合物(2.5～10mmol/L)1.0～4.0μl 引物N3(5～60μmol/L)0.5～2.5μl 引物M2(5～60μmol/L)0.5～2.5μl DNA聚合酶(5u/μl)0.25～0.5μl 第一輪PCR產(chǎn)物(1～10倍稀釋)1.0～2.0μl 無核酸酶水補充至總反應(yīng)體積50～75μl 在94℃預(yù)熱20～30分鐘，之后在94℃變性1～2分鐘，在52～55℃退火1～2分鐘，在72℃延伸1.5～2分鐘，如此循環(huán)30～35次后；再在72℃延伸20分鐘，得第二輪聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng)產(chǎn)物； E、電泳分析和滴度計算 用1.5％濃度瓊脂糖凝膠對第二輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，出現(xiàn)351bp長度的DNA特異性條帶者為陽性結(jié)果，用Reed-Muench公式計算出滴度。
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摘要
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本發(fā)明提供一種快速、靈敏檢測甲肝減毒活疫苗病毒感染性滴度的方法，它通過檢測甲肝病毒復(fù)制時出現(xiàn)的標(biāo)志物負(fù)鏈RNA中間體來確定病毒的存在，突破了現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)不能區(qū)分感染性甲肝病毒和失活病毒的局限，同時克服了細(xì)胞培養(yǎng)法存在的步驟繁雜，耗時較長，常導(dǎo)致疫苗庫存期長，縮短疫苗有效期等不足，使培養(yǎng)時間由一個月縮短至八天，大大縮短了檢測周期，病毒培養(yǎng)過程中勿需替換維持液，降低了污染的機率，減少了常規(guī)方法中細(xì)胞后處理步驟如反復(fù)凍融、超聲，降低工作量，有效提高工作效率，通過對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物的測序提供病毒遺傳信息。
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國際公布
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