| 公開(公告)號(hào) | CN1766115A |
| 公開(公告)日 | 2006.05.03 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200510043192.5 |
| 申請(qǐng)日期 | 2005.09.06 |
| 專利名稱 | 腫瘤血管導(dǎo)向肽與人干擾素α-2b的融合蛋白的制備方法 |
| 主分類號(hào) | C12N15/62(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12N15/62(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C07K1/16(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 顏 真;孟潔如;張英起 |
| 地址 | 710032陜西省西安市長(zhǎng)樂(lè)西路17號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 |
| 代理人 | 李鄭建 |
| 國(guó)省代碼 | 陜西;61 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽NGR與人干擾素α-2b融合蛋白的制備方法，其特征在于，按以下步驟制備： 1)IFNα-2b-NGR融合基因的克隆 選擇人白細(xì)胞cDNA文庫(kù)，首先設(shè)計(jì)一對(duì)引物將5’端和3’端的酶切位點(diǎn)分別突變?yōu)镹deI和BamHI； 引物1(26nt)：5’-CGCATATGTGTGATCTGCCTCAAACC-3’ 引物2(58nt)：5’-CGGGATCCTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAGTTTGTTGACAAAGAAAAAGATC-3′ 對(duì)人白細(xì)胞cDNA文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增； PCR擴(kuò)增反應(yīng)管的配制均在冰浴中進(jìn)行，配制過(guò)程中，先加水、模板cDNA及其他反應(yīng)組分，95℃反應(yīng)5min，再加入Taq酶，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為：94℃，60s變性反應(yīng)；55℃，60s退火反應(yīng)；72℃，60s擴(kuò)增反應(yīng)，進(jìn)行30次循環(huán)，于72℃延伸10min； PCR產(chǎn)物用NdeI和BamHI雙酶切后，經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的片段，命名為mutantIFNα-2b； 按照大腸桿菌慣用密碼子設(shè)計(jì)并合成了編碼NGR導(dǎo)向肽的核酸片斷，這兩個(gè)片段退火后可形成含13個(gè)氨基酸的導(dǎo)向肽片段以及5’端和3’端的粘性末端即BamHI和SalI的切點(diǎn)； 片段1(46nt)：5’-GATCCTGCAACGGTCGTTGCGTGAGCGGTTGCGCGGGTCGTTGCTG-3’ 片段2(46nt)：5’-TCGACCTAGCAACGACCCGCGCAACCGCTCACGCAACGACCGTTGCAG-3’ 將合成的兩個(gè)片段于煮沸變性5min，然后退火，再與mutantIFNα-2b及用NdeI和SalI處理過(guò)的pET-22b(+)質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定，獲得插入片段大小正確的IFNα-2b-NGR融合基因原核表達(dá)載體，進(jìn)行DNA序列分析，測(cè)序正確者命名為pET-22b(+)-IFNα-2b-NGR，其中含有編碼腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽NGR與IFNα-2b融合蛋白的基因； 3)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的質(zhì)粒pET-22b(+)-IFNα-2b-NGR轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，隨機(jī)挑選單克隆菌，于LB中30℃活化振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日晨以1∶100比例接種LB培養(yǎng)基，其中含Amp100μg/ml，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD650nm＝0.6時(shí)，加入終濃度為0.1mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，3000rpm離心15min收集菌體，行SDS-PAGE及WesternBlot，對(duì)SDS-PAGE結(jié)果進(jìn)行用薄層掃描以測(cè)定目的蛋白的表達(dá)量。 4)重組蛋白的純化 按1克菌體加入5ml的STE緩沖液，其配方為100mMNaCl，50mMTris，pH8.0，1mMEDTA，將菌體重懸，然后加入融菌酶0.5mg/g及DOC5ug/g，室溫?cái)嚢?0min；再加入DNase20ug/g，靜置20min后，4℃離心15min，12,000rpm，棄上清液，收集沉淀；用洗滌液3MUrea，2％TritonX-100，STE洗滌沉淀后，按1克菌體加入20ml洗滌液，4℃離心15min，12,000rpm，棄上清液，再收集沉淀；將沉淀在緩沖液中徹底溶解，緩沖液的配方為6.5M鹽酸胍，1％β巰基乙醇，25mMTris；對(duì)PBS透析24h，其PBS的pH為7.2，4℃離心10min，12,000rpm，收集到的上清用PBS充分平衡的親和色譜層析柱層析純化，洗脫液為0.1M甘氨酸，其pH為2.5，連續(xù)梯度洗脫5個(gè)柱床體積，收集洗脫液，進(jìn)行活性測(cè)定和SDS-PAGE檢測(cè)； 5)重組蛋白的體外生物學(xué)活性檢測(cè) WISH細(xì)胞在含抗生素和谷氨酰胺的10％FSC，pH7.4的Eagle’s培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)后，消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)；將消化的WISH細(xì)胞，按1,000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，37℃孵箱培養(yǎng)過(guò)夜，換入用含5％FCS的Eagle’s液稀釋的不同濃度的IFN裂菌上清，繼續(xù)培養(yǎng)，次日用含2％FCS的Eagle’s培養(yǎng)液按1∶10-30稀釋的VSV病毒培養(yǎng)液，換入細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，以50％細(xì)胞保護(hù)的IFN稀釋度為IFN效價(jià)。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽NGR與人干擾素α-2b(IFNα-2b)融合蛋白的制備方法。本發(fā)明選用從噬菌體展示文庫(kù)中篩選出的能與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高效表達(dá)的CD13結(jié)合的含13個(gè)氨基酸的環(huán)肽NGR，利用基因工程方法將其融合在IFNα-2b的羧基末端，制備的腫瘤新生血管特異性結(jié)合多肽NGR與IFNα-2b的融合蛋白，能在腫瘤新生血管處富集，從而提高干擾素α-2b的治療特異性，減少全身用量，降低毒副反應(yīng)，提高量效比。 |
| 國(guó)際公布 |
