| 公開(公告)號 | CN1212404C |
| 公開(公告)日 | 2005.07.27 |
| 申請(專利)號 | CN02110068.3 |
| 申請日期 | 2002.02.07 |
| 專利名稱 | 一種提高埃博霉素A產(chǎn)量的發(fā)酵工藝方法 |
| 主分類號 | C12P17/02 |
| 分類號 | C12P17/02;//(C12P17/02,C12R1:01) |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 山東大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 李越中;胡瑋;劉新利;韓冠君 |
| 地址 | 250100 山東省濟(jì)南市山大南路27號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 濟(jì)南三達(dá)專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 孫君 |
| 國省代碼 | 山東;37 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種提高埃博霉素A產(chǎn)量的發(fā)酵工藝方法，該方法具體步驟順序如下：(1)發(fā)酵菌株的選擇：粘細(xì)菌菌株中纖維堆囊菌(Sorangiumcellulosum)ATCC15384；(2)粘細(xì)菌菌株在保持代謝產(chǎn)物合成能力前提下，液體培養(yǎng)均勻生長的馴化：將上述菌株接種在固體斜面培養(yǎng)基上，固體培養(yǎng)基成分為：大豆蛋白胨5～15g/L，馬鈴薯淀粉15～25g/L，CaCl2.2H2O1g/L，MgSO4.7H2O1g/L，F(xiàn)e-EDTA8mg/L，瓊脂粉15g/L；30℃，培養(yǎng)5天后，接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：大豆蛋白胨5～15g/L，馬鈴薯淀粉15～25g/L，CaCl2.2H2O1g/L，MgSO4.7H2O1g/L，F(xiàn)e-EDTA8mg/L；30℃，120轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)5～7天，將上述培養(yǎng)菌重新接回至固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，依原條件培養(yǎng)后再接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，如此重復(fù)傳代馴化，在95～100代時(shí)，培養(yǎng)的菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長呈現(xiàn)適應(yīng)性的均勻化生長，表現(xiàn)為菌體細(xì)胞在液體中由原來的聚團(tuán)狀態(tài)變成了均勻生長狀態(tài)，同時(shí)細(xì)胞生長的代時(shí)縮短，生長量提高，達(dá)到最大細(xì)胞量的時(shí)間由原來的10～12天，縮短至5～7天，獲得的最大細(xì)胞量由原來的1～4×108細(xì)胞/ml，增加到5～10×109細(xì)胞/ml；(3)發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化：將步驟(2)均勻化生長的菌株接種至固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基成分同上，30℃，培養(yǎng)5天后，接種至含有樹脂的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：碳源是地瓜淀粉、馬鈴薯淀粉、葡聚寡糖、木聚糖之一，濃度均為20g/L，氮源是水解乳蛋白、大豆蛋白胨、酒石酸銨、檸檬酸銨之一，濃度均為10g/L，CaCl2.2H2O1g/L，MgSO4.7H2O1g/L，F(xiàn)e-EDTA8mg/L，樹脂選擇XAD-16，添加量為20ml/L；發(fā)酵容器為500ml三角瓶，內(nèi)含200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)5～7天；(4)綜合消除代謝產(chǎn)物對菌株產(chǎn)生埃博霉素的影響：將上述菌株接種至固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基成分同上，30℃，培養(yǎng)5天后，接種至含有樹脂的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為地瓜淀粉20g/L，水解乳蛋白10g/L，CaCl2.2H2O1g/L，MgSO4.7H2O1g/L，F(xiàn)e-EDTA8mg/L，樹脂選擇XDA，AB-8或混合樹脂之一，添加量為10～40ml/L；發(fā)酵容器為500ml三角瓶，內(nèi)含200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)6～7天；上述混合樹脂是指CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六種樹脂按重量比0.8～1.2∶0.8～1.2∶1.8～2.2∶0.8～1.2∶2.8～3.2∶1.8～2.2混合；(5)埃博霉素A的分離提取純化：發(fā)酵結(jié)束后，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的樹脂取出，經(jīng)甲醇浸提，浸提物再經(jīng)過離子交換，分子篩和高效液相提取純化，即得到埃博霉素A。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種提高粘細(xì)菌次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，即提高粘細(xì)菌中埃博霉素(Epothilone)產(chǎn)生菌纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)的代謝產(chǎn)物埃博霉素A產(chǎn)量的方法。該方法包括1)對成團(tuán)生長的粘細(xì)菌液體均勻生長的馴化方法，2)適合埃博霉素A產(chǎn)生的地瓜淀粉、水解乳蛋白等的選定以及3)綜合地消除產(chǎn)物代謝積累的混合樹脂添加方法等步驟，從而使得埃博霉素A產(chǎn)物的產(chǎn)量達(dá)到62.7mg/L的水平。 |
| 國際公布 |
