| 公開(公告)號 | CN100350046C |
| 公開(公告)日 | 2007.11.21 |
| 申請(專利)號 | CN200510026026.4 |
| 申請日期 | 2005.05.20 |
| 專利名稱 | 轉(zhuǎn)外源基因技術(shù)提高黃芪甲苷含量 |
| 主分類號 | C12N15/63(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/63(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C12N15/74(2006.01)I;C12N15/82(2006.01)I;C12N5/04(2006.01)I;A01H4/00(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 上海中醫(yī)藥大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 杜 旻;胡之璧;王子艷;劉 滌;周吉燕;倪躍元 |
| 地址 | 201203上海市浦東新區(qū)蔡倫路1200號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 上海新天專利代理有限公司 |
| 代理人 | 王 巍 |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種轉(zhuǎn)外源基因技術(shù)提高黃芪甲苷含量的方法，其特征在于該方法包括下列步驟： 1)質(zhì)粒pBI121的提取 反應(yīng)試劑的配制：LB液體培養(yǎng)基；溶液1為50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，10mM乙二胺四乙酸，pH8.0；溶液2為0.2MNaOH，1％十二烷基硫酸鈉；溶液3為5MKAc60ml，HAc11.5ml，無菌雙蒸去離子水28.5ml；酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1混合液；核糖核酸酶20μg/ml；無水乙醇；70％乙醇； 操作程序：取2ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，加入15ml的通氣良好的試管中，然后從轉(zhuǎn)化平板上挑一單菌落，37℃，300rpm，培養(yǎng)過夜；取1.5ml培養(yǎng)物，4℃，12000rpm，離心0.5min，倒去上清液，沉淀加100μl溶液1重新懸浮細(xì)菌，劇烈震蕩；加200μl溶液2，蓋緊蓋子，快速顛倒混勻，置冰上；加150μl冰預(yù)冷的溶液3，蓋緊蓋子，顛倒混勻，置冰上3～5min；12000rpm，4℃，離心5min，上清轉(zhuǎn)移；加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液，振蕩混勻，4℃，12000rpm，離心10min，轉(zhuǎn)移上清液；在上清中加2倍體積乙醇，室溫放置2分鐘；12000rpm，4℃，離心5min；棄上清，沉淀；加1ml70％乙醇洗滌，4℃，12000rpm，離心10min，沉淀空氣干燥10min；加50μl含核糖核酸酶的無菌雙蒸去離子水溶解脫氧核糖核酸，儲存于-20℃待用； 2)雙酶切： 10×雙酶切緩沖液10μl，限制性核酸內(nèi)切酶XbaI10U/μl3μl，限制性核酸內(nèi)切酶SacI10U/μl3μl，脫氧核糖核酸10μg，無菌雙蒸去離子水 37℃水浴1hr，取出75℃滅活內(nèi)切酶；取5μl電泳鑒定，其余部分酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1萃取純化后，加1/10體積的3MNaAc，2倍體積的乙醇沉淀脫氧核糖核酸；靜置10min后，12000rpm，4℃，離心10min，沉淀用70％乙醇洗滌兩次后晾干約10min，加適量的無菌水溶解，進(jìn)行連接； 3)感受態(tài)細(xì)菌的制備： 從-70℃低溫冰箱取出大腸桿菌DH5α，接種于LB平板，37℃培養(yǎng)過夜進(jìn)行活化，從活化平皿上挑取單菌落，接入5ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜250rpm，次日按1％體積比轉(zhuǎn)入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)至OD600＝0.3～0.6，在無菌條件下，將50～100ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入兩個(gè)預(yù)冷的無菌離心管中，冰上靜置10min，4℃，4000rpm離心10min，棄去上清液，倒置流盡培養(yǎng)液，加10ml預(yù)冷的0.1MCaCl2溶液，重懸浮細(xì)菌，冰浴30min，4℃，4000rpm離心10min，棄去上清液，加2ml預(yù)冷的0.1MCaCl2溶液，重懸浮細(xì)菌，即為感受態(tài)細(xì)胞； 4)引物設(shè)計(jì)： 根據(jù)透明顫菌血紅蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，預(yù)計(jì)片斷長度451bp； 正向：5′-AAGGATCCATGTTAGACCAGCAAACC-3′ 反向：5′-ACAAGCTTATTCAACCGCTTGAGC-3′ 5)質(zhì)粒與插入片段的連接 10×連接緩沖液1μl，透明顫菌血紅蛋白基因經(jīng)雙酶切純化得到的脫氧核糖核酸片斷，插入片段和載體pBI121的摩爾比例為2∶1，T4脫氧核糖核酸連接酶5U/μl1μl，無菌雙蒸去離子水，16℃水浴過夜，連接液用于轉(zhuǎn)化； 6)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 模板1μl，正向引物5μM2μl，反向引物5μM2μl，10×緩沖液2μl，MgCl225mM1.6μl，脫氧核酸核苷三磷酸10mM0.5μl，脫氧核糖核酸聚合酶3U/μl0.3μl，無菌雙蒸去離子水； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min，反應(yīng)完畢后，取4μl反應(yīng)產(chǎn)物上樣于1.0％瓊脂糖凝膠電泳； 7)轉(zhuǎn)化與克隆篩選： 取100μl感受態(tài)細(xì)胞，加4μl步驟5)得到的連接液，冰浴30min后，42℃熱激1.5min，冰上冷卻1～2min；加SOC培養(yǎng)基800μl，于37℃，180rpm培養(yǎng)1hr；取培養(yǎng)物100μl鋪于含50μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法篩選攜帶中間載體pBI121-vgb的大腸桿菌； 8)三親雜交法將透明顫菌血紅蛋白基因轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌： 接種發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402在含有100μg/ml利福平的YMB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)至單菌落長出，挑單菌落接種于加100μg/ml利福平的YMB液體培養(yǎng)基，28℃，250rpm培養(yǎng)40hr，按1％的接種比例將農(nóng)桿菌接種于YMB液體培養(yǎng)基中，28℃，250rpm培養(yǎng)至OD600為0.5，接種含有協(xié)助質(zhì)粒的大腸桿菌pRK2013以及攜帶中間載體pBI121-vgb的大腸桿菌于含50μg/ml卡那霉素固體LB培養(yǎng)基上，37℃，300rpm培養(yǎng)過夜，當(dāng)單菌落長出后，分別挑單菌接種于含50μg/ml卡那霉素液體LB培養(yǎng)基中，37℃，300rpm培養(yǎng)過夜，按1％的接種比例將協(xié)助菌和含中間載體的細(xì)菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃，300rpm培養(yǎng)至OD600為0.5，將三種菌等體積混勻后，取50μl接種于直徑2cm的無菌濾紙上置于YMB固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)一天，用適量無菌水沖洗濾紙片，收集洗出的菌液，均勻涂布于含有100μg/ml利福平，50μg/ml卡那霉素的YMB固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)四天后出現(xiàn)單菌落，挑單菌落進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定，陽性菌落接種于含有100μg/ml利福平，50μg/ml卡那霉素的YMB液體培養(yǎng)基，28℃，250rpm，培養(yǎng)過夜，再對菌液提取質(zhì)粒脫氧核糖核酸進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定，確定的陽性菌LBA9402-vgb； 9)轉(zhuǎn)透明顫菌血紅蛋白基因發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)外源基因技術(shù)提高黃芪甲苷含量的方法。本發(fā)明將透明顫菌血紅蛋白基因(vgb基因)經(jīng)改造后，采用酶切結(jié)合PCR技術(shù)，將vgb基因插入質(zhì)粒pBI121，獲得以35s-CaMV強(qiáng)啟動(dòng)子為啟動(dòng)元件的中間表達(dá)載體pBI121-vgb，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α。采用三親雜交法(pRK2013、DH5α和LBA9402)，獲得轉(zhuǎn)vgb基因的發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402-vgb。用其侵染黃芪無菌苗，獲得轉(zhuǎn)基因黃芪毛狀根，經(jīng)測定其中黃芪甲苷含量高于未轉(zhuǎn)基因毛狀根含量5倍。 |
| 國際公布 |
