氟苯尼考聯(lián)合用藥對產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌抗菌活性的
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超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是由質粒介導、主 要由大腸埃希菌和
肺炎克雷伯菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶，能水解
青霉素類，第1代、第2代、第3代和部分第4代頭孢菌素及
氨曲南，可在菌株間轉移或傳播[1,2]。近年來，第3代頭孢菌素的廣泛應用使產(chǎn)ESBLs的細菌不斷增加，已成為獸醫(yī)臨床感染的重要病原菌。值得注意的是，產(chǎn)ESBLs菌株不僅對β-內(nèi)酰胺抗生素耐藥，并且也對氟喹諾酮類、氨基糖苷類、
氯霉素類、
四環(huán)素類等多種抗菌藥產(chǎn)生耐藥性，這就為動物細菌病的治療提出了新的挑戰(zhàn)。氟苯尼考是氯霉素類獸用廣譜抗生素，主要用于治療畜禽及魚類的細菌性疾病，隨著在獸醫(yī)臨床上的廣泛使用，畜禽的致病菌尤其是產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象越來越嚴重[3,4]。因此，尋找合理的聯(lián)合用藥已成為控制耐藥菌尤其是產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌感染亟待解決的問題。鑒此，就氟苯尼考與幾種抗菌藥的聯(lián)合用藥進行藥物敏感性試驗，從而為氟苯尼考復方制劑的研制及臨床合理配伍用藥控制產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌感染提供依據(jù)。1 材料和方法1．1 材料1．1．1 受試菌株 質控菌株：大腸埃希菌硼ATCC25922，購于中國藥品生物制品鑒定所；臨床菌株：7株受試大腸桿菌均從山東病
雞肝臟中分離，河南農(nóng)業(yè)大學藥理實驗室保存。1．1．2 藥物和藥敏紙片 氟苯尼考原粉(95%)、黏菌素(90%)、頭孢噻呋(95%)、痢菌凈(98%)、
磷霉素鈉(65%)、
多西環(huán)素(95%)、
阿米卡星(65%)，均由河南牧翔動物藥業(yè)有限公司提供；
頭孢噻肟(30μg/片)、
頭孢曲松(30μg/片)、氨曲南(30μg/片)、
頭孢他啶(30μg/片)、頭孢噻肟/克拉維酸(30/1Oμg每片)、頭孢他啶/克拉維酸(30/10μg每片)由北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司提供。1．1．3 培養(yǎng)基、試劑 血平板瓊脂(鄭州安圖生物技術有限公司)、麥康凱瓊脂(北京奧博星生物技術有限責任公司)、M -H 瓊脂(北京奧博星生物技術有限責任公司)、M -H 肉湯(青島高科園海博生物技術有限公司)、G-N增菌液(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、革蘭氏染色液(鄭州理利生物工程有限公司)。1．1．4 儀器 SW -CJ-JC型超凈工作臺、Pyx-DHx型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、手提式壓力蒸汽滅菌器、DZF一6050型真空干燥箱、全自動電子分析天平、新飛電冰箱等。1．2 方法1．2．1 菌液制備 將經(jīng)過鑒定的雞大腸桿菌分離株接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16～18h，挑選單個菌落接種于G-N 增菌液中37℃過夜培養(yǎng)，使菌液濃度相當于108cfu／mL。試驗時稀釋1000倍，使稀釋后的菌液濃度為105cfu/mL[5,6]。1．2．2 藥物原液的配制[5,6] 用分析天平精確稱取適量藥物后，無菌操作使其溶于適宜的溶劑，置4℃ 冰箱中保存?zhèn)溆�，配制藥�?周內(nèi)用完。1．2．3 ESBLs表型篩選 采用美國國家臨床實驗室標準委員會(CLSI，M100-S16)推薦的方法，將增菌培養(yǎng)的菌液均勻涂布于M -H 瓊脂上，按照標準紙片擴散法的規(guī)定進行，于平板上分別貼上頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南藥敏片，37℃ 過夜培養(yǎng)之后，如抑菌圈直徑滿足以下任一條件即可懷疑其為產(chǎn)ESBLs菌株：頭孢噻肟≤ 27mm，頭孢他啶≤22mm，頭孢曲松≤25mm，氨曲南≤27mm。1．2．4 ESBLs的確認試驗(雙紙片增效法)[7] 采用美國國家臨床實驗室標準委員會(CLSI，M100-S16)推薦的方法，將疑似產(chǎn)酶的增菌培養(yǎng)的菌液均勻涂布于M -H瓊脂板上，將頭孢噻肟、頭孢噻肟／克拉維酸、頭孢他啶、頭孢他啶／克拉維酸藥敏片兩兩對應，分別貼在同一個M -H 瓊脂板上，37℃ 過夜孵育之后，當2組藥物有任意1組出現(xiàn)加克拉維酸比不加克拉維酸的抑菌圈直徑≥5mm時，即確認為產(chǎn)ESBLs。1．2．5 藥敏試驗用微量液體2倍稀釋法，分別測定氟苯尼考單方藥物和復方藥物對7株大腸桿菌的最小抑菌濃度。試驗中，菌液濃度應為105cfu/mL，置于37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中，18～24h后觀察結果，能抑制細菌生長的最小藥物濃度為MIC。2 結果與分析2．1 ESBLs的表型篩選試驗及確認試驗中抑菌圈直徑大小雞大腸桿菌ESBLs的表型篩選、確認試驗結果分別見表1、表2。從表1可以看出，頭孢噻肟的抑菌圈直徑≤27mm 的菌有6株，頭孢他啶的抑菌圈直徑≤22mm 的菌有7株，頭孢曲松的抑菌圈直徑≤25mm的菌有5株，氨曲南的抑菌圈直徑≤27mm 的菌有6株，故7株菌均可能產(chǎn)ESBLs。從表2可以看出，7株可疑產(chǎn)ESBLs菌株經(jīng)確認試驗檢測，藥物中加克拉維酸后，抑菌圈直徑明顯增大。其中有6株菌出現(xiàn)頭孢噻肟/克拉維酸的抑菌圈直徑比頭孢噻肟大5mm，有5株菌出現(xiàn)頭孢他啶/克拉維酸的抑菌圈直徑比頭孢他啶大于等于5mm。7株可疑產(chǎn)ESBLs菌株均為產(chǎn)ESBLs的陽性菌株。2．2 藥敏試驗結果單藥和復方藥物對7株臨床分離的產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌的MIC值見表3。從表3可看出，7株大腸桿菌對多肽類黏菌素顯示高度敏感，而對頭孢菌素類頭孢噻呋耐藥率達100%，對氨基糖苷類阿米卡星耐藥率達71%，對四環(huán)素類多西環(huán)素耐藥率達57%，對喹啉類痢菌凈耐藥率達100%，對磷霉素耐藥率達57%。說明這7株產(chǎn)ESBLs菌不但對β-內(nèi)酰胺抗生素耐藥，而且顯示較高的多重耐藥特性。氟苯尼考與黏菌素復配時，雖說以氟苯尼考計抗菌活性顯著增強，但是由于單藥黏菌素對7株產(chǎn)酶菌抗菌活性均較強，氟苯尼考與黏菌素(1：1)復配時的MIC與單藥黏菌素的MIC幾乎一樣，氟苯尼考與黏菌素(1：2)復配時，可能是黏菌素的用量加倍的緣故，MIC值普遍降低，由此看出，黏菌素單藥使用時就可抑制本試驗中的7株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌。氟苯尼考與頭孢噻呋復配，3個比例均沒能使抗菌活性增強。氟苯尼考與阿米卡星3個比例復配時，43 的菌株抗菌活性有所提高，其中以1：2的比例復配時MIC值下降程度最大。氟苯尼考與多西環(huán)素3個比例復配時，7株菌的MIC值在不同比例下均有不同程度的下降，尤其以1：2比例復配時下降幅度最大。氟苯尼考與痢菌凈只有1：2比例復配時，57 的菌株MIC值呈現(xiàn)較小程度下降。氟苯尼考與磷霉素聯(lián)合用藥時，只有2株菌在1：1和1：2的比例復配時MIC有所降低。3 討論1)本試驗中分離的7株雞大腸桿菌，經(jīng)檢測均產(chǎn)ESBLs，100%的高檢出率，說明產(chǎn)ESBLs菌株呈直線上升趨勢。近年來，隨著第3代動物專用廣譜頭孢菌素在雞病防治中的廣泛應用以及第3代醫(yī)用頭孢的濫用，導致大腸桿菌耐藥現(xiàn)象相當嚴重，給臨床治療造成較大的困難。這些耐藥菌絕大多數(shù)產(chǎn)ESBLs，自1983年德國首次發(fā)現(xiàn)此酶以來，與之相關的國內(nèi)外報道日益增多，產(chǎn)ESBLs菌的種類也越來越多，逐漸引起關注。2)分離出的7株產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌，不僅對頭孢噻呋100%耐藥，而且對氯霉素類氟苯尼考100%耐藥，對氨基糖苷類阿米卡星71 耐藥，對四環(huán)素類多西環(huán)素57%耐藥，對喹啉類痢菌凈100％耐藥，對磷霉素57%耐藥。由此可以看出，產(chǎn)ES-BLs菌株不僅對β-內(nèi)酰胺酶抗生素耐藥，而且呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。這與胡功政等[7] 相關報道一致。菌株產(chǎn)酶使藥物失活是細菌產(chǎn)生耐藥性的機制之一，產(chǎn)ESBLs菌株，能夠使青霉素或頭孢菌素的β-內(nèi)酰胺環(huán)斷裂而使β-內(nèi)酰胺藥物失效。但產(chǎn)酶菌同時對多種藥物產(chǎn)生的多重耐藥性機制，還有待進一步研究。3)氟苯尼考屬動物專用的廣譜抗生素，為氯霉素的結構同系物，其作用機理及抗菌譜與氯霉素和甲砜霉素相似，氯霉素有嚴重的致
再生障礙性貧血的不良反應，而氟苯尼考彌補了此種不足。因此，在動物疾病防治上，氟苯尼考替代了氯霉素，在獸醫(yī)臨床發(fā)揮著重要的作用[8,9]。近年來，由于抗菌藥物的濫用，致使大量耐藥菌株產(chǎn)生，氟苯尼考的抗菌作用也逐漸降低，人們不得不去尋找新的解決辦法。結合本次試驗結果來看，氟苯尼考與6種藥物聯(lián)合用藥時，與頭孢噻呋復配完全無效，這與理論上是相符的，頭孢噻呋是I類速效殺菌劑抗菌藥，氟苯尼考是Ⅲ類速效抑菌劑，I類和Ⅲ類合用時Ⅲ類藥物可迅速阻斷細菌的蛋白質合成，致細菌基本處于靜止狀態(tài)，因此，和I類合用時有導致后者活性減弱的可能，二者不宜合用。而其他幾類藥均能使一部分菌株的抗菌活性有所提高，均以1：2效果最佳，其中以氟苯尼考與多西環(huán)素1：2配伍，7株菌的MlC值下降幅度最大，6種聯(lián)合用藥中這一組合最好，這與苑麗等[10]報道的相一致。原本對氟苯尼考耐藥的產(chǎn)ESBLs菌株在聯(lián)合用藥以后，抗菌活性明顯提高，從而可以看出，聯(lián)合用藥是一個控制產(chǎn)ESBLs菌感染的有效途徑。
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