動(dòng)脈粥樣硬化病灶主要涉及兩類血管細(xì)胞即血管內(nèi)皮細(xì)胞和中膜平滑肌細(xì)胞（SMC)，本節(jié)主要就這兩類細(xì)胞進(jìn)行討論，介紹一般培養(yǎng)和鑒定方法。
一、血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法和特性
人和動(dòng)脈不同部位、不同血管如大動(dòng)脈與小動(dòng)脈、毛細(xì)血管，以及靜脈血管之間存在差異，在處理這些細(xì)胞時(shí)應(yīng)分別對(duì)待。血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)較小，近似圓形，呈均勻排列，一般取材于人和動(dòng)物的臍帶。
1．人大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)
人大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞可來自手術(shù)、病理活檢組織，也可來自尸體（需在死后24h內(nèi)取材)，在取材過程中應(yīng)注意無菌操作。
（1)方法：小心剝除已游離的大血管外膜，置于盛有冷的磷酸鹽平衡鹽溶液平皿中反復(fù)漂洗，洗凈血管內(nèi)、外面的血液和脂質(zhì)，然后剪開血管，放入37℃消化液中，60min，消化結(jié)合后，用23號(hào)針頭注射器吸取m.quanxiangyun.cn/job/消化液沖洗血管內(nèi)腔，最后收集消化液置無菌試管中，離心（1000rpm 7min)棄上清，加入含血清培養(yǎng)基中，使細(xì)胞重新懸并調(diào)整細(xì)胞數(shù)，接種于相應(yīng)大小培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，37℃恒溫溫箱培養(yǎng)，一周后內(nèi)皮細(xì)胞可長(zhǎng)成單層，呈多角形鋪成石狀排列。
（2)注意事項(xiàng)：①如果小于23號(hào)針頭則回收內(nèi)皮細(xì)胞效果差，若針頭過大則注射器內(nèi)壓大會(huì)吸入緊貼內(nèi)皮細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞，因此注意使用恰當(dāng)?shù)尼橆^；②人血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求高，是依賴于生長(zhǎng)因子的一種細(xì)胞。常用的培養(yǎng)基為RPMi 1640，培養(yǎng)時(shí)添加15% FBS，15%Nu-Serum，5～20μg/ml的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ECGF)以及100μg/ml的肝素。改進(jìn)的培養(yǎng)基有MCDB109培養(yǎng)基，市場(chǎng)上也有內(nèi)皮細(xì)胞商品培養(yǎng)基，可根據(jù)需要選擇購(gòu)買；③培養(yǎng)基中必須加入相應(yīng)抗生素，最終濃度：慶大霉素為15μg/ml，氨芐青霉素為50μg/ml，二性霉素B1～2μg/ml，二甲胺四環(huán)素1μg/ml。在48h內(nèi)可以防止細(xì)胞感染，3日后還應(yīng)添加慶大毒素。此方法也適用于人大靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)，但靜脈壁薄，操作困難，細(xì)胞容易老化。
2．高度動(dòng)脈硬化的血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)動(dòng)脈硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)基的要求同正常內(nèi)皮細(xì)胞，技術(shù)關(guān)鍵是分離細(xì)胞。動(dòng)脈硬化內(nèi)皮細(xì)胞層混有脂肪斑化，粥樣腫脹的巨噬細(xì)胞。除去這種巨噬細(xì)胞最有效的方法是利用內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比重的差異，通過離心的方法達(dá)到分離的目的。通常用淋巴細(xì)胞分離液，首先經(jīng)消化液處理，將所得內(nèi)皮細(xì)胞的沉渣放入不含血清的8mlRPMi 1640www.med126.com液再漂浮后，預(yù)先在另一試管加入5ml淋巴細(xì)胞分層液（比重1.0717)，再將細(xì)胞輕輕加入。加完后，800xg，23℃離心30min，內(nèi)皮細(xì)胞沉著于管底，巨噬細(xì)胞漂浮于上層。
3．臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)
在嬰兒出生時(shí)立即將臍帶放置于無菌的500ml磷酸鹽溶液（PBS)中低溫保存。次日分離細(xì)胞。臍帶有一根靜脈兩根動(dòng)脈，通常用內(nèi)腔大靜脈。將洗凈的靜脈一端用夾子夾緊，一端注入消化液，靜置孵育片刻。然后PBS或培養(yǎng)液反復(fù)抽吸內(nèi)腔，收集后與消化液一并離心、沉淀內(nèi)皮細(xì)胞。所用培養(yǎng)基與大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基相同，臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞易于培養(yǎng)，既使不加生長(zhǎng)因子在最初幾代細(xì)胞也會(huì)增殖良好。
二、血管內(nèi)皮細(xì)胞特性
1．血管內(nèi)皮細(xì)胞重要標(biāo)志
（1)第Ⅷ因子關(guān)連抗原（von willebrand factor,VWF)，可以由全身所有血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，檢測(cè)這一因子主要用相應(yīng)抗體。VWF有其特異性，人的VWF抗體對(duì)牛的內(nèi)皮細(xì)胞沒有交叉反應(yīng)。兔疫熒光間接法測(cè)定該因子，陽性細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的熒光顆粒，在核周圍的顆粒較密，細(xì)胞邊緣顆粒較少。
（2)Weibel-Palade小體，該小體是血管內(nèi)皮細(xì)胞又一特異性的標(biāo)志。電子顯微鏡下，呈現(xiàn)0.1～0.3μm,長(zhǎng)0.5～5μm的橢圓形棒狀結(jié)構(gòu)。上述的VWF就是該小體產(chǎn)生的。
2．培養(yǎng)的大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)
培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞從形態(tài)學(xué)上可分為兩類。其一，占培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的大部分，直徑在50～70μm，類圓形或多角形的小型細(xì)胞，這一類被稱為典型內(nèi)皮細(xì)胞，呈單層鋪路石樣排列，占嬰幼兒、青少年血管內(nèi)皮細(xì)胞的大部分。另一類是直徑在100～200μm的大型內(nèi)皮細(xì)胞，這類細(xì)胞通常帶有兩個(gè)以上的細(xì)胞核，被稱為非典型內(nèi)皮細(xì)胞。非典型內(nèi)皮細(xì)胞是成人的大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，與動(dòng)脈硬化和老化有關(guān)。
一般來說，血管內(nèi)皮細(xì)胞隨著年齡的增加，使典型的內(nèi)皮細(xì)胞慢慢地轉(zhuǎn)變?yōu)榉堑湫蛢?nèi)皮細(xì)胞；年齡越大，非典型的內(nèi)皮細(xì)胞含量越高。細(xì)胞生長(zhǎng)方面，動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞比靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，嬰幼兒血管內(nèi)皮細(xì)胞比成人或高齡者內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)能力強(qiáng)，體外培養(yǎng)的這兩種細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞間存在顯著差異。
