臨床生物化學(xué):第二節(jié)　臨床生化方法的建立

一、方法建立的原理確定

臨床生化方法按其傳統(tǒng)分類可分為光譜法、層析法、電泳法、酶法、電化學(xué)法、分子生物學(xué)和免疫化學(xué)法等，這些方法的建立首先要根據(jù)其技術(shù)的原理（詳見前面有關(guān)章節(jié))和被測物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)來確定其方法建立的原理，例如亮度法測定的對象是各種有色物質(zhì)，有色物質(zhì)溶液的顏色深淺與其濃度有一定的關(guān)系，濃度大時色深，濃度小時色淺，比較顏色的深淺即可測知待測物質(zhì)的濃度。為此，首先要知道待測物質(zhì)本身是否有色，若本身無色，能與何種物質(zhì)在什么條件下呈色，弄清后即可與一已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作比較，然后分別測出兩者的吸亮度，從郎伯-比耳定律可得知：

由于分析的物質(zhì)相同，處理也一樣，故K值相同，再因?yàn)闇y定時用同樣比色皿（L₁＝L₂)，所以光度法中測得未知液與標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的比值就等于其濃度的比值。（A₁/A₂＝C₁/C₂)。如C₁為未知物濃度，則可得到計(jì)算公式如下：

C₁＝A₁×C₂/A₂

只要再乘以測定時標(biāo)本的稀釋倍數(shù)，即為通常光度法測定的通用的計(jì)算公式，但此公式只有在測定時空白管為零的條件下才適用。

二、方法建立時的條件選擇

在方法建立的原理確定后，尚需根據(jù)其原理來選擇合適的條件，以保證所建的方法可靠。下面以亮度法為例介紹其條件選擇的主要環(huán)節(jié)。顏色反應(yīng)是亮度分析的基礎(chǔ)，因此，用作亮度測定的顏色反應(yīng)至少要具備以下幾條：反應(yīng)有較高的特異性，從而干擾�。环磻�(yīng)產(chǎn)生的有色物質(zhì)吸光系數(shù)要大，大者靈敏度高；有色產(chǎn)物的離解度要小，小則穩(wěn)定；此外，還要求有色產(chǎn)物有恒定的組成成分，使產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定。由于影響顏色反應(yīng)的因素很多，如溫度、pH、試劑濃度、反應(yīng)的時間等等。這些因素在建立新方法時都要逐項(xiàng)試驗(yàn)，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。

（一)選擇合適的吸收光譜

實(shí)際上就是測定顏色反應(yīng)產(chǎn)生的光吸收曲線。方法是在整個可見光區(qū)（400-700nm)以10nm（在接近最大吸收波長范圍還應(yīng)再細(xì)分)間隔。分為十幾個點(diǎn)測定其在不同波長時的吸光度，然后以吸光度為縱坐標(biāo)，波長為橫坐標(biāo)繪成光吸收曲線。在條件許可的情況下，應(yīng)采用雙光束分光光度計(jì)在可見光區(qū)進(jìn)行波長掃描，結(jié)果較為可靠。同時，還應(yīng)以同法分別測定其空白液和標(biāo)準(zhǔn)物顏色產(chǎn)物的吸收曲線。測定光吸收曲線的目的是找出最大吸收波長，作為光度法波長選擇的依據(jù)。因?yàn)樵谧畲笪�收波長測定，可獲得最大靈敏度，且能更符合比耳定律。然而在實(shí)際使用中，不能單純考慮靈敏度高，還要考慮在測定濃度范圍能否符合比耳定律，并能在光度計(jì)準(zhǔn)確區(qū)域內(nèi)（吸光度0.2-0.85之間)讀出讀數(shù)。有時由于測定的最大吸收波長并不是所要測定物質(zhì)的特性吸收波長，即同時存在具有相似最大吸收的干擾物質(zhì)，為了保證實(shí)驗(yàn)的特異性，常改用特有而非最大吸收波長進(jìn)行測定。例如用磷鉬酸測定血糖，選用波長420nm，溶液對此波長的吸收比其它波長光線的吸收都低，其目的是使參考值有一個較低的吸收，這樣可允許在相同情況下對高出參考值的血糖也能得到準(zhǔn)確的讀數(shù)。因?yàn)樵谶@項(xiàng)測定中，高血糖是常見的變化方向。

（二)測定方法適用的濃度范圍

根據(jù)光吸收定律，溶液的吸光度應(yīng)與溶液的濃度成正比。但由于有色物質(zhì)的電離、水解、締合等原因當(dāng)溶液稀釋或增濃時，有色物質(zhì)顏色的深淺并不按比例降低或增高，因而也就不符合光吸收定律。測定方法適用的濃度范圍是指分析的濃度范圍在直線線性段，濃度與吸光度之比為一常數(shù)，此時直線上任何一點(diǎn)的斜率tanθ相等，即：

tanθ＝A1/C1＝A2/C2＝A3/C3＝……＝An/Cn＝K

此處K即為校正常數(shù)，可用于結(jié)果計(jì)算。

通常稀溶液都是符合比耳定律的，但在濃度過高和過低時往往都不呈直線，說明低濃度部分亦有儀器的靈敏度和方法的檢測能力限制，所以，具體的測定就宜選擇在直線段濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。以此還可用于確定標(biāo)本的用量，使具有臨床意義的標(biāo)本測定結(jié)果都落在直線范圍內(nèi)。

（三)觀察影響顏色反應(yīng)的因素

影響顏色反應(yīng)的主要因素有：溶液pH的影響、雜質(zhì)的影響、反應(yīng)的溫度和時間、以及顏色的穩(wěn)定性等。這些都是光度法測定誤差的主要來源。都需要通過實(shí)驗(yàn)來觀察并控制在一個適宜的范圍內(nèi)。從而保證方法的準(zhǔn)確性和精密性。

⒈溶液pH的影響有些溶液的顏色對pH值的改變非常靈敏。例如白蛋白在pH4左右可與溴甲酚綠結(jié)合后由黃色變成綠色，綠色的深淺與白蛋白濃度成正比，但是溴甲酚綠本身是一種pH指示劑，當(dāng)pH5.4時即由黃色轉(zhuǎn)變成綠色，在pH3.8時又由綠色變?yōu)辄S色。在白蛋白與溴甲酚綠結(jié)合顏色反應(yīng)中，如pH控制不好就很容易出現(xiàn)誤差，又如每種酶都有各自的最適pH，酶促反應(yīng)中，只有在其最適pH時才能發(fā)揮充分的催化活性。因此，在建立方法時可在不同pH值條m.quanxiangyun.cn件下（其它條件不變)令其反應(yīng)，以觀察顏色反應(yīng)的吸光度變化，從而選擇合適的pH值范圍來保證顏色反應(yīng)，以求較高的靈敏度和較好的線性。有時還需用相應(yīng)的pH緩沖液來維持反應(yīng)的pH，以利顏色反應(yīng)的正常進(jìn)行。

⒉雜質(zhì)的影響由于臨床生化標(biāo)本中除含待測物質(zhì)外，還含有許多非測定物質(zhì)，成分十分復(fù)雜，它們有的可與有色產(chǎn)物作用，使產(chǎn)生的顏色逐漸退去，有的與待測物質(zhì)相類似，也能緩慢地與顯色試劑生成有色化合物或沉淀，有的本身是有色的等，都會影響被測物溶液的顏色。試驗(yàn)方法是將各種可疑物質(zhì)的純?nèi)芤鹤鳂?biāo)本單獨(dú)進(jìn)行測定，如產(chǎn)生顏色反應(yīng)，這說明該方法的特異性不高。如果將待測物質(zhì)混入可疑物質(zhì)作標(biāo)本測定，改變了被測物質(zhì)與試劑間的反應(yīng)，這是干擾（具體方法見第三節(jié))。為此就需要進(jìn)一步改進(jìn)方法，或設(shè)立標(biāo)本空白，或?qū)��?biāo)本作適當(dāng)處理，除去干擾物，或加入合適的干擾物掩蔽劑等，以提高方法的特異性。

⒊反應(yīng)的溫度和時間有些有色物質(zhì)能迅速反應(yīng)生成，另一些有色物質(zhì)須經(jīng)過相當(dāng)長時間后反應(yīng)才能完全。提高反應(yīng)的溫度可以加速化學(xué)反應(yīng)，縮短反應(yīng)的時間。因此，如果在不恰當(dāng)?shù)臏囟群蜁r間內(nèi)進(jìn)行比色，將會造成相當(dāng)大的誤差。這可以在不同的溫度下（如設(shè)定25℃，30℃，37℃)令其反應(yīng)，通過檢測吸光度來觀察各自反應(yīng)終點(diǎn)時間（一般達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，隨后測定的吸光度不再變化)，以選定適宜臨床應(yīng)用的反應(yīng)最佳溫度和時間。

⒋穩(wěn)定性試驗(yàn)待測物質(zhì)經(jīng)顯色反應(yīng)產(chǎn)生的有色物穩(wěn)定與否，關(guān)系到測定結(jié)果的可靠性。某些有色物質(zhì)雖然生成很快，但卻不太穩(wěn)定，放置后色澤會逐步消退或起變化，有些干擾物雖不能與被測物質(zhì)同時發(fā)生顏色反應(yīng)，但當(dāng)放置一段時間后也能緩慢地與試劑顯色，使溶液顏色加深。因此，在方法建立的同時作穩(wěn)定性試驗(yàn)很有必要。試www.med126.com驗(yàn)的方法是用被測標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白溶液按方法要求進(jìn)行顯色反應(yīng)后，即刻及室溫放置不同時間，分別測定其吸光度，根據(jù)其吸光度的變化確定方法穩(wěn)定的時間范圍。一般要求有色溶液能穩(wěn)定二小時以上就能滿足臨床應(yīng)用的需要。必要時還要加以注明。

三、方法建立后的臨床觀察

方法建立的目的是為了更好地應(yīng)用于臨床，為疾病的診斷和治療提供可靠的依據(jù)。因此，在方法建立后必須作臨床觀察試驗(yàn)。

（一)正常參考值試驗(yàn)

制定參考值（referencevalues)時，首先要閱讀有關(guān)資料，依照經(jīng)典的文獻(xiàn)作為研究設(shè)計(jì)的依據(jù)，使設(shè)計(jì)盡量合理，結(jié)果令人信服，有實(shí)用價(jià)值。1978年，國際臨床化學(xué)委員會下屬的“參考值”理論專家組發(fā)表專門文件，推薦出一套有關(guān)參考值的概念、定義、建立和使用方案。參考值的建立應(yīng)包括參考個體、參考人群、參考標(biāo)本、參考值、參考分布、參考限和參考區(qū)間。它們之間的關(guān)系如下：

具體試驗(yàn)是對選定的一定人群中的健康人，按性別、年齡等分組，每組至少100人，應(yīng)用所建立方法測定，如所得某體液成分的結(jié)果呈正態(tài)分析，經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理求出均值（X)和標(biāo)準(zhǔn)差（S)，然后將X±2S定為正常參考范圍。但如膽紅素、鐵、尿素及堿性磷酸酶等，常呈不對稱的偏態(tài)分布，需經(jīng)適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)處理，使之接近正態(tài)分布的形式，這樣就可參照正態(tài)分析數(shù)據(jù)一樣來對待。常用的有對數(shù)轉(zhuǎn)換法，使每一個數(shù)值轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的對數(shù)值，用其對數(shù)值作圖，若呈正態(tài)分布，則利用此對數(shù)值計(jì)算X和S值，最后將結(jié)果轉(zhuǎn)換回為相應(yīng)的自然對數(shù)值，求得均值及參考值的上限和下限。確定的參考值要求符合以前的調(diào)查報(bào)告。

（二)臨床病例觀察試驗(yàn)

臨床病例觀察的目的是指出所建方法的某項(xiàng)試驗(yàn)，對特定疾病的預(yù)示值（PV)。預(yù)示值為一項(xiàng)診斷試驗(yàn)確定或排隊(duì)某疾病存在與否的診斷概率。預(yù)示值尚可分為陽性預(yù)示值（PV⁺)和陰性預(yù)示值（PV^－)它們分別表示確定診斷或排除診斷的把握有多大，是診斷試驗(yàn)的評價(jià)指標(biāo)。診斷試驗(yàn)評價(jià)指標(biāo)除預(yù)示值外，還有診斷特異性、診斷靈敏度和準(zhǔn)確度。這些指標(biāo)都與疾病的發(fā)生率有關(guān)。現(xiàn)將有關(guān)名詞的概念，作簡要地介紹。

⒈真陽性者（TP)經(jīng)試驗(yàn)而被正確分類的患者的數(shù)目。

⒉假陽性者（FP)經(jīng)試驗(yàn)而被錯誤分類的無病試者的數(shù)目。

⒊真陰性者（TN)經(jīng)試驗(yàn)而被正確分類的無病試者的數(shù)目。

⒋假陰性者（FN)經(jīng)試驗(yàn)而被錯誤分類的患病試者的數(shù)目。

⒌診斷靈敏度 患病試者的陽性百分率。

⒍診斷特異性 無病試者的陰性百分率。

⒎陽性結(jié)果的預(yù)示值（PV^＋)陽性結(jié)果中真陽性者的百分?jǐn)?shù)。

⒏陰性結(jié)果的預(yù)示值（PV^－)陰性結(jié)果中真陰性者的百分?jǐn)?shù)。

⒐實(shí)驗(yàn)的總有效率所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果中正確結(jié)果的百分?jǐn)?shù)。

在臨床應(yīng)用中，主要以陽性結(jié)果的預(yù)示值觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果的使用價(jià)值。但在固定參考范圍的條件下，對不同發(fā)病率的人群進(jìn)行相同指標(biāo)檢測時，所得到的預(yù)示值會有很大變化。例如用某方法對某�？撇》繖z測100個標(biāo)本，發(fā)病率為50％，方法診斷靈敏度為95％，診斷特異性為95％。由此數(shù)據(jù)可知：

TP＝50×95％＝47.5人；FN＝50－47.5＝2.5人；

TN＝50×95％＝47.5人；FP＝50－47.5＝2.5人；

TP＋FP＝50人，TN＋FN＝50人

臨床對該檢測方法的運(yùn)用滿意。經(jīng)同樣方法用于普查，調(diào)查某地區(qū)發(fā)病率為5％，檢測1000例中，950人為非病人，50人為病人。

TP＝50×95％＝47.5人；FN＝50－47.5＝2.5人；

TN＝950×95％＝902.5人；FP＝950－902.5＝47.5人；

PV^＋＝47.5/95×100％＝50％

PV^－＝902.5/905×100％＝99.7％

總有效率＝(47.5+902.5)/(95+905)×100％＝95％

臨床認(rèn)為這個檢驗(yàn)方法使用價(jià)值不高，因?yàn)樵谄詹橹屑訇栃月收?0％，給進(jìn)一步診斷帶來困難。如可能可調(diào)整參數(shù)值范圍來提高方法的使用價(jià)值。一般認(rèn)為，用于過篩實(shí)驗(yàn)的分析方法，希望有最高的靈敏度；用于確診實(shí)驗(yàn)的分析方法，必須有高特異性。

（三)質(zhì)量控制觀察

方法是用控制物隨臨床常規(guī)標(biāo)本一起用所建方法測定，連續(xù)測定一個月。以觀察在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和精密性，判斷是否滿足臨床應(yīng)用的要求，具體做法見第二十一章。