以常用熒光素作為標(biāo)記物的熒光免疫測(cè)定往往受血清成分、試管、儀器組件等的本底熒光干擾，以及激發(fā)光源的雜射光的影響，使靈敏度受到很大限制。時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（timeresolvedfluorescenceimmunoassay，TR-FIA)是針對(duì)這缺點(diǎn)加以改進(jìn)的一種新型檢測(cè)技術(shù)。其基本原理是以鑭系元素銪（Eu)螯合物作熒光標(biāo)記物，利用這類熒光物質(zhì)有長熒光壽命的特點(diǎn)，延長熒光測(cè)量時(shí)間，待短壽命的自然本底熒光完全衰退后再行測(cè)定，所得信號(hào)完全為長壽命鑭系螯合物的熒光，從而有效地消除非特異性本底熒光的干擾。TR-FIA的測(cè)定原理見圖17-4。以雙抗體夾心法為例的測(cè)定反應(yīng)程序見圖17-5。其中增強(qiáng)液的作用是使熒光信號(hào)增強(qiáng)。因?yàn)槊庖叻磻?yīng)完成后，生成的抗原－抗體－銪標(biāo)記物復(fù)合物在弱堿性溶液中，經(jīng)激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光信號(hào)甚弱。在增強(qiáng)液中可至pH2～3，銪離子很容易解離出來，并與增強(qiáng)液中的β-二酮體生成帶有強(qiáng)烈熒光的新的銪螯合物，大大有利于熒光測(cè)量。
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圖17-4 TR-FIA測(cè)定原理示意圖
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圖17-5 雙抗體夾心法TR-FIA反應(yīng)程序示意圖
所用檢測(cè)儀器為時(shí)間分辨熒光計(jì)，與一般的熒光分光光度計(jì)不同，采用脈沖光源（每秒閃爍1000次的氙燈)，照射樣品m.quanxiangyun.cn/yaoshi/后即短暫熄滅，以電子設(shè)備控制延緩時(shí)間，待非特異本底熒光衰退后，再測(cè)定樣品發(fā)出的長鑭系熒光。檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.2～1ng/ml。
熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的偏振光藍(lán)光（波長485nm)照射后，可吸收光能躍入激發(fā)態(tài)；在恢復(fù)至基態(tài)時(shí)，釋放能量并發(fā)出單一平面的偏振熒光（波長525nm)。偏振熒光的強(qiáng)度與熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度成反比。大分子物質(zhì)旋轉(zhuǎn)慢，發(fā)出的偏振熒光強(qiáng)；小分子物質(zhì)旋轉(zhuǎn)快，其偏振熒光弱。利用這一現(xiàn)象建立了熒光偏振免疫測(cè)定（floutescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA)，用于小分子物質(zhì)特別是藥物的測(cè)定。
FPIA的試劑為熒光素標(biāo)記的藥物和抗藥物的抗體，模式為均相競爭法，標(biāo)本中的藥物與熒光標(biāo)記的藥物與一定量的抗體競爭結(jié)合。反應(yīng)平衡后，與抗體結(jié)合的熒光標(biāo)記藥物的量與標(biāo)本中藥物濃度的量呈反比。由于抗體的分子量遠(yuǎn)大于藥物的分子量，游離的熒光標(biāo)記藥物與結(jié)合抗體的熒光標(biāo)記藥物所產(chǎn)生的偏振熒光強(qiáng)度相差甚遠(yuǎn)。因此在FPIA中測(cè)定的偏振熒光強(qiáng)度與標(biāo)本中藥物的濃度呈反比。
