三、肝癌免疫細胞化學(xué)
原發(fā)性肝細胞癌（簡稱肝癌)是世界上較常見的惡性腫瘤之一，特別在非洲和亞洲一些地區(qū)肝癌發(fā)病率較高。自從發(fā)現(xiàn)乙型肝炎抗原（HBAg)以來，給HBV與肝癌發(fā)病關(guān)系的研究開辟了新的途徑。近年來用免疫細胞化學(xué)技術(shù)及分子雜交技術(shù)對HBV與肝癌發(fā)病關(guān)系的研究更加深入和廣泛，并取得一定成果。全世界各地通過大量的流行病學(xué)、免疫病理學(xué)、分子遺傳學(xué)等研究結(jié)果表明，HBV感染與肝癌的發(fā)病有密切關(guān)系，普遍認為HBV是肝癌發(fā)病的主要原因。目前尚不完全清楚HBV致癌機理，是具有直接致癌作用或間接致癌作用，這有待進一步研究。
�。ㄒ�)HBV與原發(fā)性肝癌的流行病學(xué)證據(jù)
HBV與原發(fā)性肝癌關(guān)系的研究已有20余年，目前對HBV作為肝癌病因的證據(jù)日益增多，特別是對HBV的分子生物學(xué)的研究表明，HBV可能具有直接致癌作用。如下事實可作為臨床學(xué)和流行病學(xué)的證據(jù)：
�。�1)原發(fā)性肝癌常發(fā)生在HBV流行區(qū)，而非流行區(qū)則發(fā)病率很低。
�。�2)血清學(xué)研究表明：生活在HBV流行區(qū)的肝癌病人50%～90%HBsAg陽性，而對照組僅為5%～15%；抗-HBc為80%～90%，而對照組為15%～35%。近年來研究表明，肝癌病人抗-GBx的檢出率在85%左右。而對照組很低。些標志物被認為是目前正在發(fā)生HBV感染或先前有HBV持續(xù)感染的證據(jù)。甚至在歐美肝癌發(fā)病率很低的國家，肝癌病人HBsAg，抗-HBc和抗-HBx檢出率也明顯比對照組高。從大量的研究結(jié)果表明，在HBV流行區(qū)HBV攜帶者肝癌發(fā)病的相對危險性比非攜帶者高十倍，甚至幾百倍。
�。�3)在HBV流行的人群中，HBV攜帶者與肝癌家庭聚集性的早期觀察，生活早期嬰兒從母親傳播感染是HBV慢性攜帶者，后代亦易成為慢性攜帶者。Larouze 等發(fā)現(xiàn)塞內(nèi)加爾患肝癌的母親中71%HBsAg陽性，而相應(yīng)的對照組僅為13%，在朝鮮和我國臺灣省也觀察到同樣的現(xiàn)象。預(yù)防母-嬰的HBV傳播，對預(yù)防肝癌的發(fā)生具有重要意義，從研究家族病例來看，大多數(shù)最終發(fā)生肝癌的個體在出生時或是出生后第一年內(nèi)從攜帶HBV的母親或兄弟姐妹間獲得感染。
�。�4)約80%的肝癌病例發(fā)生在肝硬變或慢性活動性肝炎的基礎(chǔ)上，而肝硬變和慢性活動性肝炎雙往往由HBV慢性持續(xù)性感染引起的。在亞洲和非洲一些地區(qū)，肝硬變病人90%以上HBsAg陽性，慢性活動性肝炎病人75%以上HBsAg陽性，而對照組只有6%～14%HBsAg陽性。
�。ǘ�)肝硬變與肝癌的關(guān)系
大多數(shù)肝癌病合并有肝硬變，部分肝硬變病人可發(fā)展為肝癌，這一事實早已被人們所注意。大多數(shù)報道肝癌合并肝硬變?yōu)?0%～90%。肝癌合并肝硬變的類型主要為壞死后大結(jié)節(jié) 型肝硬變，約占70%～80%，少數(shù)為混合型，合并小結(jié)節(jié) 型肝硬變少見。肝硬變發(fā)展為肝癌的百分率，各報道差別較大，但大多數(shù)報道為20%左右。壞死后大結(jié)節(jié) 型肝硬變與乙型肝炎病毒感染有密切關(guān)系，HBsAg陽性率很高，達70%～80%。Blumberg等（1977)報道在84例肝硬變中有24例HBsAg陽性，其中6例（25%)發(fā)展成肝癌。Obata(1980)指出，HBsAg陽性的肝硬變有23%發(fā)生癌變，Nayak（1977)報道，肝硬變發(fā)生癌變的機會和其HBsAg陽性有關(guān)，HBsAg陽性的肝硬變發(fā)生肝癌的機會為51%，而與HBsAg陽性的大結(jié)節(jié) 型肝硬變有密切關(guān)系。大結(jié)節(jié) 型肝硬變常伴有肝細胞的不典型增生，而伴有不典型增生的肝硬變HBsAg陽性檢出率很高，表明肝細胞不典型增生與HBsAg慢性持續(xù)感染有密切關(guān)系。有人認為不典型增生的肝細胞是一種癌前期病變。
�。ㄈ�)肝細胞肝癌及癌周肝組織內(nèi)HBV抗原的分布
目前用組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)及免疫電鏡等技術(shù)可以在人肝癌及癌旁肝細胞內(nèi)檢測到HBsAg、前S1、前S2、HBcAg(HBeAg)及HBxAg等。
1．肝癌及癌周肝組織內(nèi)HBsAg定位及分布在肝癌組織內(nèi)，HBsAg陽性率一般來說比較低，大多數(shù)報道其陽性率在10%～15%，少數(shù)報道陽性率可高達25～44%。肝癌細胞內(nèi)HB－sAg陽性主要見于分化好的肝癌病例，少數(shù)亦見于中度分化及分化差的肝癌病例。一般來說，癌周肝組織內(nèi)HBsAg陽性率明顯高于癌組織。大多數(shù)文獻報道，癌周肝組織內(nèi)HBsAg陽性率為60%～80%，少數(shù)報道在90%以上。癌周肝組織內(nèi)HBsAg陽性主要見于癌周肝硬變中，特別是大結(jié)節(jié) 肝硬變中。這一結(jié)果表明，HBV與肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系。肝癌及癌周肝組織內(nèi)HBsAg陽性的形態(tài)和分布狀態(tài)，不同病例表現(xiàn)不同，就是同一病例不同部位也有很大差異。HBsAg陽性細胞分布亦不規(guī)律。絕大多數(shù)HBsAg陽性物質(zhì)位于胞漿內(nèi)，部分位于胞膜上，少數(shù)位于核內(nèi)。HBsAg陽性物質(zhì)呈細顆粒狀、絮狀或網(wǎng)狀。HBsAg陽性物質(zhì)在細胞內(nèi)分布有三種類型：全胞漿型，陽性物質(zhì)充滿整個胞漿；包涵體型，陽性物質(zhì)集聚成團，位于核旁一側(cè)；胞周型或核周型，陽性物質(zhì)沿著泡膜或核膜分布，呈環(huán)狀。在肝癌及癌周肝組織內(nèi)包涵體型或全胞漿型較多見。HBsAg陽性細胞的分布有三種類型：彌漫型，多數(shù)陽性細胞彌漫分布于切片內(nèi)；局灶型，少數(shù)陽性細胞集聚于某一區(qū)域；散在型，陽性細胞較少，孤立的或零散的分布于切片內(nèi)。一般來說，癌周肝組織HBsAg陽性反應(yīng)強度和陽性細胞檢出率比癌組織高。癌組織檢出率低的原因，可能是由于癌組織不適于HBsAg的復(fù)制，或是由于HBv DNA和宿主DNA發(fā)生整合，而HBsAg不易表達所致。至于HBsAg在肝癌發(fā)病中的作用，目前尚不清楚。一般認為HBsAg作為靶抗原，通過免疫反應(yīng)，造成肝細胞的損傷，肝細胞增生，不典型增生，最終可能導(dǎo)致癌變。
2．肝癌及癌周肝組織內(nèi)前S抗原的定位及分布對肝癌及癌周肝組織內(nèi)前S（pre-S1和pre-S2)抗原的研究遠不及對HBsAg的研究。近來，國內(nèi)外文獻有少數(shù)報道。在肝癌組織內(nèi)前S1和前S2抗原的檢出率為20%左右，略比HBsAg檢出率高。在癌周肝組織前S1和前S2抗原的檢出率為60%左右，這個和HBsAg的檢出率基本相似。在絕大多數(shù)HBsAg陽性的病例前S1和前S2抗原亦陽性，而在部分前S1和前S2陽性病例，HBsAg卻呈陰性反應(yīng)。因為在基因構(gòu)成上，前S1包括前S2和HBsAg，前S2包括HBsAg的部分，故前S1和前S2的表達要比HB－sAg強。用免疫組化方法染色，前S1和前S2陽性物質(zhì)呈棕紅色呈均勻細顆粒狀，主要位于癌細胞及肝細胞的胞漿內(nèi)，有些病例則和/或位于胞膜上及核內(nèi)。陽性物質(zhì)反應(yīng)的強弱和前S1或前S2抗原的含量有關(guān)。一般來說，前S1或前S2陽性反應(yīng)強度和陽性細胞檢出率，癌周肝組織比癌組織強。這一規(guī)律和HBsAg相同。前S1或前S2陽性物質(zhì)在細胞內(nèi)的分布情況及其陽性細胞分布狀態(tài)和HBsAg的基本相似。目前對前S1或前S2抗原在肝癌發(fā)病中的作用尚不完全清楚。有人研究證明，在人肝細胞膜上存在兩種不同的受體，一種受體可以直接與前S1蛋白結(jié)合；另一種受體通過多聚人血清白蛋白（PHSA)與前S2蛋白結(jié)合。所以HBV通過PHSA介質(zhì)結(jié)合在肝細胞上，從而形成靶抗原，通過免疫反應(yīng)引起肝細胞的損傷，進而可能發(fā)生肝細胞的增生，不典型增生，最終導(dǎo)致癌變。
3．肝癌及癌周肝組織內(nèi)HBcAg(HBeAg)的定位及分布到目前為止，在肝癌細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)有HBcAg只有少數(shù)報道。所有的報道，HBcAg的檢出率都不太高，大多在10%～20%左右。HBcAg和HBeAg在肝癌及癌周肝組織內(nèi)不易檢出或檢出率較低的原因，可能是由于HBcAg 和抗HBc常以免疫復(fù)合物的形式存在于胞核內(nèi)，HBcAg被封閉之故；亦可能由于HBcAg基因和宿主基因進行了整合，使HBcAg不再表達出來。HBcAg和HBeAg經(jīng)常并存，因此HBeAg亦經(jīng)常不易單獨檢出。HBcAg或HBeAg陽性物質(zhì)呈均勻細顆粒狀分布于胞核內(nèi)，少數(shù)見于核仁內(nèi)。位于核內(nèi)常呈圓形或卵圓形，圍繞核仁占據(jù)整個核或占據(jù)核的大部分。少數(shù)病例HBcAg陽性物質(zhì)位于胞漿內(nèi)或胞膜上，有的病例核、膜及漿內(nèi)同時陽性。HBcAg陽性細胞的分布與HBsAg的分布相似。
關(guān)于肝癌的免疫學(xué)方面的研究，血清學(xué)方面的研究較多，組織學(xué)研究的較少。大量的流行病學(xué)和臨床學(xué)方面的資料表明，肝癌患者血清中抗-HBc明顯高于對照組，其陽性率高達70%～95%。用免疫組化技術(shù)在肝癌及癌旁肝組織內(nèi)亦發(fā)現(xiàn)有抗-HBc的存在。有人證實抗-HBc為IgG，這種IgG經(jīng)常和HBcAg以復(fù)合物的形式存在于細胞核內(nèi)，少數(shù)也見于胞漿及胞膜上。并證實，IgG只見于含有HBcAg的胞核內(nèi)，而無核內(nèi)HBcAg，就無抗-HBc存在。因此，如果能測出IgG（抗-HBc)，也就間接地證實了HBcAg的存在。IgG(抗-HBc)陽性呈圓形或卵圓形位于核內(nèi)或以包涵體位于胞漿內(nèi)。IgG陽性細胞的分布狀態(tài)和HBcAg的分布相同。IgG(抗-HBc)在肝癌發(fā)病中起何作用，目前尚不清楚，有人認為IgG和HBcAg形成免疫復(fù)合的，由于免疫反應(yīng)，在慢性活動性肝炎發(fā)病中和肝硬變形成中起重要作用，而慢活肝和肝硬變又是肝癌發(fā)生的重要環(huán)節(jié) 。HBcAg和抗-HBc形成的免疫復(fù)合物是否為癌變的始動因素，還有待進一步研究。
4．肝癌及癌周肝組織內(nèi)HBxAg的定位及分布近年來，對HBV分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了HBV另一種抗原，即HBxAg。HBxAg和肝癌發(fā)生的關(guān)系密切，已引起人們廣泛的重視。目前，國內(nèi)外已有少數(shù)文獻報道關(guān)于HBxAg和肝癌發(fā)病的關(guān)系的研究。在人原發(fā)性肝癌組織內(nèi)HBxAg的檢出率大約為60%～80%，這明顯高于HBsAg的檢出率。在癌周肝組織內(nèi)HBxAg陽性檢出率在70%～80%，這和HBsAg的檢出率基本相似。用PAP或ABC方法檢測HBxAg，其陽性物質(zhì)呈棕褐色均勻細顆粒狀，主要位于癌細胞和肝細胞胞漿內(nèi)，部分病例除胞漿陽性外，胞膜或核亦陽性（約20%)，單獨膜型或核型少見。不同病例HBxAg陽性物質(zhì)的分布及陽性反應(yīng)強度是不同的，就是同一病例不同部位，其結(jié)果也不盡相同。一般來說，癌周肝組織內(nèi)HBxAg陽性檢出率及陽性反應(yīng)強度比癌組織內(nèi)高。其反應(yīng)強弱與HBxAg含量多少有關(guān)。HBxAg陽性細胞分布與HBsAg陽性細胞分布相似，亦分為散在型，局灶型和彌漫型。在癌周硬變組織內(nèi)，HBxAg陽性細胞有時圍繞小血管分布。有的則沿著纖維膈分布。在HBxAg陽性病例，有24%在癌組織內(nèi)伴有HBsAg和/或HBcAg，有72%在癌周肝組織內(nèi)伴有HBsAg和/或HBcAg。HBx－Ag在肝癌發(fā)病中的作用，目前尚不完全清楚。有人報道在肝癌患者血清中含有較高的抗-HBx，其檢出率高達85%。Miyaki等（1986)發(fā)現(xiàn)在所檢查的原發(fā)性肝細胞癌組織中都存在和HBV的X基因相同的DNA序列。有些作者認為，宿主細胞DNA和HBv DNA的整合是通過X基因區(qū)特殊的重組來完成的，其翻譯產(chǎn)物-HBx蛋白（HBxAg)對癌基因具有反式激活作用，而引起細胞癌變。最近有人通過HBV的X基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中誘發(fā)肝癌的動物實驗證明，HBx蛋白能夠改變宿主基因的表達，并導(dǎo)致肝細胞癌的發(fā)生。因此，有些作者認為HBxAg在肝癌發(fā)生中具有重要作用，并認為HBV可能具有直接致癌作用。
