�。ㄋ�)抗原的分離與純化
從細胞中提取出來的生物大分子是不純凈的，必須進一步分離純化才能獲得純品。在生物大分子制備工作中，分離純化是比較復(fù)雜和重要的一個環(huán)節(jié)。對于異類的物質(zhì)，如提純蛋白質(zhì)和酶時混雜著核酸，提純核酸時混雜著蛋白質(zhì)或多糖，一般可用專一性酶水解、有機溶劑抽提、選擇性分部沉淀等方法處理，小分子物質(zhì)常在整個制備過程中多次液相與固相互相轉(zhuǎn)化被分離或最后用透析方法除去。而對同類物質(zhì)，如酶和雜蛋白，RNA和DNA以及不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)、酶、核酸之間的分離，情況則復(fù)雜得多，主要應(yīng)用的方法有鹽析法、有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法、吸附法、結(jié)晶法、電泳法、超速離心法、柱層析法等。其中鹽析法、等電點法、結(jié)晶法用于蛋白、酶的提純較多；有機溶劑抽提和沉淀用于核酸提純較多；柱層析法、梯度離心法在蛋白質(zhì)和核酸的提純工作中應(yīng)用均十分廣泛。本節(jié) 側(cè)重對蛋白質(zhì)、酶和核酸分離純化中與溶解度有關(guān)的一些方法作一簡要敘述。
1．蛋白質(zhì)分離純化的一些方法
�。�1)鹽析法
①原理：鹽析法對于許多非電解質(zhì)的分離純化都是適合的，也是蛋白質(zhì)和酶提純工作應(yīng)用最早，至今仍廣泛使用的方法。其原理是蛋白質(zhì)、酶在低鹽濃度下的溶解質(zhì)隨著鹽液濃度升高而增加（此時稱為鹽溶)；當鹽濃度不斷上升時，蛋白質(zhì)和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，稱為蛋白質(zhì)的鹽析。這一現(xiàn)象是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間電荷的極性基團有著靜電引力，當水中加入少量鹽類時，由于鹽類離子與水分子對蛋白質(zhì)分子上的極性基團的影響，使蛋白質(zhì)在水中溶解度增大。但鹽濃度增加到一定程度時，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)就相互聚集而沉淀析出。鹽析法就根據(jù)不同蛋白質(zhì)和酶在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達到彼此分離的方法。
�、邴}的選擇：蛋白質(zhì)鹽析常用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨，其優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度大（25℃時飽和溶解度為4.1mol/L,即767g/L;0℃時飽和溶解度為3.9mol/L，即676g/L)，在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來，而且硫酸銨價廉易得，分段效果比其他鹽好，不容易引起蛋白質(zhì)變性。應(yīng)用硫酸銨時，對蛋白氮的測定有干擾，緩沖能力比較差，故有時也應(yīng)用硫酸鈉，如鹽析免疫球蛋白，用硫酸鈉的效果也不錯，硫酸鈉的缺點是30℃以上溶解度太低。其他的中性鹽如磷酸鈉的鹽析作用比硫酸銨好，但也由于溶解度太低，受溫度影響大，故應(yīng)用不廣。
硫酸銨濃溶液的pH在4.5～5.5之間，市售的硫酸銨常含有少量游離硫酸，pH值往往降至4.5以下，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié) 。
③硫酸銨飽和度計算法及加入方式：在分段鹽析時，加鹽濃度一般以飽和度表示，飽和溶液的飽和度定為100%。用硫酸銨鹽析時其溶液飽和度調(diào)整方法有3種。一是當?shù)鞍踪|(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的濃度不高時，可加入飽和硫酸銨溶液；飽和硫酸銨配制方法可加入過量的硫酸銨，熱至50～60℃保溫數(shù)分鐘，趁熱濾去沉淀，再在0℃或25℃下平衡1～2天，有固體析出時即達100%飽和度。鹽析所需飽和度可按下式計算：
式中V及V0分別代表所需飽和度硫酸銨溶液及原溶液的體積，S2及S1分別代表所需達到的和原溶液的飽和度。嚴格來說，混合不同體積的溶液時，總體積會發(fā)生變化使上式造成誤差，但這由體積改變所造成的誤差一般小于2%。故可忽略不計。另一種是所需達到飽和度較高而溶液的體積又不再過分增大時，可直接加入固體硫酸銨，其加入量可按下式計算：
式中X是將1升飽和度為S1的溶液提高到飽和度為S2時所需硫酸銨的重量（g)，G及A為常數(shù)，與溫度有關(guān)。G在0℃時為707，20℃時為0.29。為方便起見，在室溫及℃時所需硫酸銨的飽和度可直接查表2-1、表2-2求出。
表2－1 室溫下由S1提高到S2時每升加固體硫酸銨的克數(shù)
| 0.10 | 0.20 | 0.25 | 0.30 | 0.35 | 0.40 | 0.45 | 0.50 | 0.55 | 0.60 | 0.65 | 0.70 | 0.75 | 0.80 | 0.85 | 0.90 | 0.95 | 1.00 | |
| 0 | 55 | 113 | 114 | 175 | 209 | 242 | 278 | 312 | 350 | 390 | 430 | 474 | 519 | 560 | 608 | 657 | 708 | 760 |
| 0.10 | 57 | 67 | 118 | 149 | 182 | 215 | 250 | 287 | 325 | 365 | 405 | 448 | 494 | 530 | 585 | 634 | 685 | |
| 0.20 | 29 | 59 | 90 | 121 | 154 | 188 | 225 | 260 | 298 | 337 | 379 | 420 | 465 | 512 | 559 | 610 | ||
| 0.25 | 29 | 60 | 91 | 123 | 157 | 192 | 228 | 265 | 304 | 345 | 386 | 430 | 475 | 521 | 571 | |||
| 0.30 | 30 | 61 | 93 | 125 | 160 | 195 | 232 | 270 | 310 | 351 | 394 | 439 | 485 | 533 | ||||
| 0.35 | 30 | 62 | 94 | 128 | 163 | 199 | 235 | 275 | 315 | 358 | 403 | 449 | 495 | |||||
| 0.40 | 31 | 63 | 96 | 131 | 166 | 205 | 240 | 280 | 322 | 365 | 410 | 458 | ||||||
| 0.45 | 31 | 64 | 98 | 133 | 169 | 206 | 245 | 286 | 330 | 373 | 420 | |||||||
| 0.50 | 32 | 63 | 100 | 135 | 172 | 211 | 250 | 292 | 335 | 380 | ||||||||
| 0.55 | 33 | 66 | 101 | 138 | 176 | 214 | 255 | 298 | 344 | |||||||||
| 0.60 | 33 | 67 | 103 | 140 | 179 | 219 | 261 | 305 | ||||||||||
| 0.65 | 34 | 69 | 105 | 143 | 182 | 224 | 267 | |||||||||||
| 0.70 | 34 | 70 | 108 | 146 | 187 | 228 | ||||||||||||
| 0.75 | 35 | 72 | 110 | 149 | 170 | |||||||||||||
| 0.80 | 36 | 73 | 112 | 152 | ||||||||||||||
| 0.85 | 37 | 75 | 114 | |||||||||||||||
| 0.90 | 37 | 76 | ||||||||||||||||
| 0.95 | 38 |
�、茺}析時注意的幾個問題
1)鹽的飽和度：鹽的飽和度是影響蛋白質(zhì)鹽析的重要因素，不同蛋白質(zhì)的鹽析要求鹽的飽和度不同。分離幾個混合組分的蛋白質(zhì)時，鹽的飽和度常由稀到濃漸次增加，每出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀進行離心或過濾分離后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第二種蛋白質(zhì)沉淀。例如用硫酸銨鹽析分離血漿中的蛋白質(zhì)，飽和度達20%時，纖維蛋白原首先析出；飽和度增至28%～33%時，優(yōu)球蛋白析出；飽和度再增至33%～50%時，擬球蛋白析出；飽和度大于50%以上時，白蛋白析出。用硫酸銨不同飽和度分段鹽析法，從牛胰中酸性提取分離可得到九種以上蛋白質(zhì)及酶。
2)pH值：在等電點時，蛋白質(zhì)溶解度最小容易沉淀析出，因此，鹽析時除個別情況外，pH值常選擇在被分離的蛋白質(zhì)等電點附近。
3)蛋白質(zhì)濃度：在相同鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越大越易沉淀，使用鹽的飽和度的極限愈低，如血清球蛋白的溶度從0.5%增到3.0%時，需用中性鹽的飽和度的最低極限從29%遞減至24%。某一蛋白質(zhì)欲進行兩次鹽析時，第1次由于濃度較稀，鹽析分段范圍較寬，第2次則逐漸收窄，例如用硫酸銨鹽析膽堿酯酶時，第1次硫酸銨飽和度為35%至60%，第2次為40%至60%。蛋白質(zhì)濃度高些雖然對沉淀有利，但濃度過高也容易引起其他雜蛋白的共沉作用，因此，必須選擇適當濃度，盡可能避免共沉作用的干擾。
表2-2 0℃下由S1提高到S2時每100ml加固體硫酸銨的克數(shù)
|
溶液的原始飽和度（%) |
飽和度 | 在0℃時所達到硫酸銨飽和度（%) | ||||||||||||||||
| 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 50 | 55 | 60 | 65 | 70 | 75 | 80 | 85 | 90 | 95 | 100 | ||
| 在100毫升中欲加固體硫酸銨的克數(shù) | ||||||||||||||||||
| 0 | 10.6 | 13.4 | 16.4 | 19.4 | 22.6 | 25.8 | 29.1 | 32.6 | 36.1 | 39.8 | 43.6 | 47.6 | 51.6 | 55.9 | 60.3 | 65.0 | 69.7 | |
| 5 | 7.9 | 10.8 | 13.7 | 16.6 | 19.7 | 22.9 | 26.2 | 29.6 | 33.1 | 36.8 | 40.5 | 44.4 | 48.4 | 52.6 | 57.0 | 61.5 | 66.2 | |
| 10 | 5.3 | 8.1 | 10.9 | 13.9 | 16.9 | 20.0 | 23.3 | 26.6 | 30.1 | 33.7 | 37.4 | 41.2 | 45.2 | 49.3 | 53.6 | 58.1 | 62.7 | |
| 15 | 2.6 | 5.4 | 6.2 | 11.1 | 14.1 | 17.2 | 20.4 | 23.7 | 27.1 | 30.6 | 34.3 | 38.1 | 42.0 | 46.0 | 50.3 | 54.7 | 59.2 | |
| 20 | 0 | 2.7 | 5.5 | 8.3 | 11.3 | 14.3 | 17.5 | 20.7 | 24.1 | 27.6 | 31.2 | 34.9 | 38.7 | 42.7 | 46.9 | 51.2 | 55.7 | |
| 25 | 0 | 2.7 | 5.6 | 8.4 | 11.5 | 14.6 | 17.9 | 21.1 | 24.5 | 28.0 | 31.7 | 35.5 | 39.5 | 43.6 | 47.8 | 52.2 | ||
| 30 | 0 | 2.8 | 5.6 | 8.6 | 11.7 | 14.8 | 18.1 | 21.4 | 24.9 | 28.5 | 32.3 | 36.2 | 40.2 | 44.5 | 48.8 | |||
| 35 | 0 | 2.8 | 5.7 | 8.7 | 11.8 | 15.1 | 18.4 | 21.8 | 25.4 | 29.1 | 32.9 | 36.9 | 41.0 | 45.3 | ||||
| 40 | 0 | 2.9 | 5.8 | 8.9 | 12.0 | 15.3 | 18.7 | 22.2 | 25.8 | 29.6 | 33.5 | 37.6 | 41.8 | |||||
| 45 | 0 | 2.9 | 5.9 | 9.0 | 12.3 | 15.6 | 19.0 | 22.6 | 26.3 | 30.2 | 34.2 | 38.3 | ||||||
| 50 | 0 | 3.0 | 6.0 | 9.2 | 12.5 | 15.9 | 19.4 | 23.0 | 26.8 | 30.8 | 34.8 | |||||||
| 55 | 0 | 3.0 | 6.1 | 9.3 | 12.7 | 16.1 | 19.1 | 23.5 | 27.3 | 31.3 | ||||||||
| 60 | 0 | 3.1 | 6.2 | 9.5 | 12.9 | 16.4 | 20.1 | 23.9 | 27.9 | |||||||||
| 65 | 0 | 3.1 | 6.3 | 9.7 | 13.2 | 16.8 | 20.5 | 21.4 | ||||||||||
| 70 | 0 | 3.2 | 6.5 | 9.9 | 13.4 | 17.1 | 20.9 | |||||||||||
| 75 | 0 | 3.2 | 6.6 | 10.1 | 13.7 | 17.4 | ||||||||||||
| 80 | 0 | 3.3 | 6.7 | 10.3 | 13.9 | |||||||||||||
| 85 | 0 | 3.4 | 6.8 | 10.5 | ||||||||||||||
| 90 | 0 | 3.4 | 7.0 | |||||||||||||||
| 95 | 0 | 3.5 | ||||||||||||||||
| 100 | 0 | |||||||||||||||||
4)溫度：由于濃鹽液對蛋白質(zhì)有一定保護作用，鹽析操作一般可在室溫下進行，至于某些對熱特別敏感的酶，則宜維持低溫條件。雖然蛋白質(zhì)在鹽析時對溫度要求不太嚴格，但在中性鹽下結(jié)晶純化時，溫度影響則比較明顯。
