除完整的細(xì)胞可作為抗原外，各種不同的細(xì)胞內(nèi)存在的各種分子量不同的物質(zhì)，也都具有全抗原或半抗原的性質(zhì)，某種抗原物質(zhì)可能是某一類細(xì)胞所特有的，可作為這種細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志。由于細(xì)胞存在著許多性質(zhì)不同的抗原物質(zhì)，有時(shí)要從這眾多的物質(zhì)中提取、純化某種抗原物質(zhì)，以供科學(xué)研究之用。
一、抗原的提取
抗原的制備是一件十分細(xì)致的工作，要制備一個(gè)高純度的抗原，需要付出艱巨的努力，制備工作涉及物理學(xué)、化學(xué)和生理學(xué)等許多領(lǐng)域的知識(shí)。根據(jù)物理或化學(xué)特性建立起來(lái)的分離、純化方法的主要原理不外乎科二個(gè)方面：①利用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別將他們分配到可用機(jī)械方法分離的兩或幾個(gè)物相中，如鹽析、有機(jī)溶劑抽提、層析和結(jié)晶等；②把混合物置于單一物相中，通過物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于不同的區(qū)域而達(dá)到分離的目的，如電泳、超速離心和超濾等。由于組織細(xì)胞內(nèi)存著許多分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同的抗原物質(zhì)，其分離方法也不一樣，就是同一類大分子物質(zhì)，因選材不同，所使用的方法也很大差別。因此很難有一個(gè)通用的標(biāo)準(zhǔn)方法供提取任何生物活性物質(zhì)使用，所以在提取前必須針對(duì)所欲提取的物質(zhì)，充分查閱文獻(xiàn)資料，選用合適的方法。如果要提取一個(gè)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)未知的抗原物質(zhì)，更需要經(jīng)過各種方法的比較探索，才能找到一些工作規(guī)律和獲得預(yù)期的效果。
抗原物質(zhì)的制備，大概要經(jīng)過如下過程：①材料的選擇和預(yù)處理；②細(xì)胞的粉碎（細(xì)胞器的分離)。③提��；④純化；⑤濃縮或干燥，保存�，F(xiàn)分別簡(jiǎn)述如下。
（一)材料的選擇及預(yù)處理
選擇什么材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩�。通常選含量高、工藝簡(jiǎn)便、成本低的材料。材料選定后，通常要進(jìn)行預(yù)處理，剔除結(jié)締組織、脂肪組織等，把組織塊剪碎。若取材后不立即進(jìn)行提取，則應(yīng)冷凍保存，動(dòng)物組織更要深低溫保存。某些容易失活的物質(zhì)，一般宜采用新鮮材料。
�。ǘ�)細(xì)胞的粉碎
除了提取體液、組織間液內(nèi)的多肽、蛋白質(zhì)、酶不需粉碎細(xì)胞外，凡要提取組織內(nèi)、細(xì)胞膜上及胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)，都必須把組織和細(xì)胞粉碎，使活性物質(zhì)充分釋放到溶液內(nèi)。不同的組織，細(xì)胞的破碎難易不一，因此所使用的粉碎方法也不完全相同。如腦、胰、肝等比較軟嫩的組織，用普通勻漿器研磨就行，肌肉、心臟等則需絞碎后再作勻漿。現(xiàn)漿常用的細(xì)胞粉碎方法介紹如后。
1．物理法
�。�1)高速組織搗碎機(jī)：通常由調(diào)速器、支架、馬達(dá)、帶桿刀葉、有機(jī)玻璃筒等組成。把材料放于筒內(nèi)（約占筒內(nèi)容積的1/3)固定筒蓋，開動(dòng)馬達(dá)，調(diào)速器由慢逐漸增至所需速度。此法適用于內(nèi)臟組織。
�。�2)玻璃勻漿器：由一個(gè)內(nèi)壁經(jīng)過磨砂的玻璃管和一根一端為球狀（球面經(jīng)過磨砂)玻璃研桿組成。把絞碎的組織置于管內(nèi)，加適量溶液，插入研桿，用手或電動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)研桿，并上下移動(dòng)。用此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)高，對(duì)大分子的破壞也少。是粉碎少量軟嫩材料（腦、胰、肝等)時(shí)常用的方法。
�。�3)超聲波處理法：多用于軟嫩組織，根據(jù)不同組織采用不同頻率，處理10～15min，超聲波處理時(shí)溶液溫度升高，使不耐熱的物質(zhì)失活，使用時(shí)為防止溫度升高，除間歇開機(jī)外，還需人工降溫，避免溶液內(nèi)存在氣泡。核酸及某些酶對(duì)超聲波很敏感，要慎用。
�。�4)反復(fù)凍融法：把待碎樣品冷卻到零下15～20。C，凍固后取出，緩慢解凍，如此反復(fù)操作，可使大部分動(dòng)物性細(xì)胞及胞內(nèi)的顆粒破碎，但也可使生物活性物質(zhì)失活。
�。�5)冷熱交替法：把材料投入90。C左右水中維持?jǐn)?shù)分鐘后取出投入冰浴內(nèi)，可使大部分細(xì)胞破碎�？捎糜谔崛〉鞍踪|(zhì)和核酸。
2．化學(xué)和生物化學(xué)法
�。�1)自溶法：把新鮮材料置于一定的pH和適宜的溫度下，利用組織細(xì)胞自身的酶系統(tǒng)把組織破壞，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)。動(dòng)物材料的自溶溫度選在0～4℃，需加少量防腐劑，自溶時(shí)間較長(zhǎng)，不易控制，不常用。
�。�2)溶菌酶處理法：多用于破壞大腸桿菌等微生物的細(xì)胞壁。在每毫升含2億個(gè)細(xì)胞的懸液中加100μg至1mg溶菌酶，37℃，保溫10min，細(xì)胞就破壞了。此外，蝸牛酶、纖維素酶也被選作破碎細(xì)菌細(xì)胞之用。
�。�3)表面活性劑處理法：較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。
�。ㄈ�)抗原的提取
提取、抽提、萃取這3個(gè)詞的含義基本相同。但一般說來(lái)，提取是指在分離純化前期，將經(jīng)過處理或粉碎了的細(xì)胞置于一定條件和溶劑中，讓被提取物充分地釋放出來(lái)的過程，而抽提則是貫穿于分離純化的整個(gè)過程中，如在制備核酸過程中，用氯仿反復(fù)提取蛋白液，用苯酚反復(fù)抽提分離DNA和RNA。影響提取的因素主要來(lái)自被提取物在提取的溶劑中的溶解度大小以及它由固相擴(kuò)散到液相的難易。一個(gè)物質(zhì)在某一溶劑中的溶解度大小和該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及使用的溶劑的理化性質(zhì)有關(guān)。一般說來(lái)，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性大分子的等電點(diǎn)遠(yuǎn)的pH值使溶解度增加。因此，在不同的抗原提取過程中，所選用的溶劑的性質(zhì)、pH值、離子強(qiáng)度、抽提溫度、介電常數(shù)等因素是提取成敗的重要因素。要達(dá)到分離提純的目的，必須靈活地應(yīng)用這些因素。
現(xiàn)將蛋白質(zhì)、核酸、多肽等抗原（半抗原)的提取方法概要敘述于下。
1．蛋白質(zhì)和酶的提取 蛋白質(zhì)是由許多氨基酸連接而成的高分子物質(zhì)，分子量從數(shù)千至百萬(wàn)。數(shù)以千計(jì)的蛋白質(zhì)，按它們的功能可分成兩大類，一類是活性蛋白，包括酶、激素蛋白、受體蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白、運(yùn)輸和貯存蛋白、防御蛋白等等，另一類是非活性蛋白，如膠原蛋白、角蛋白等，不同的蛋白質(zhì)由于其結(jié)構(gòu)的差異，它們?nèi)芙舛纫哺鞑幌嗤�。大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于有機(jī)溶劑乙醇、丙酮、丁醇等。這對(duì)選擇撮蛋白質(zhì)的溶劑具有重要意義。
（1)水溶液提�。河捎诘鞍踪|(zhì)大部分溶于水、稀酸和稀堿溶液，因此提取蛋白質(zhì)以水溶液為主，其中尤以稀鹽液和緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好，溶解度大，氫是最常用的溶劑。應(yīng)注意下列幾點(diǎn)：①鹽濃度，常用等滲溶液，尤以0.02～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液、0.15mol/L氯化鈉溶液應(yīng)用較多。如酵母脫氫酶以0.66mol/L磷酸氫二鈉溶液提取，6-磷酸葡萄糖脫氫酶以0.1mol/L碳酸氫鈉液提取，脫氧核糖核蛋白在低鹽溶液中溶解度小，就要用1mol/L以上的氯化鈉液提取，而某些脂肪酶，用水提取比低鹽溶液提取效果更好。②pH值的選擇對(duì)蛋白質(zhì)提取頗為重要，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的溶解度和穩(wěn)定性與pH值關(guān)系很大。提取液的pH值首先要保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范疇內(nèi)，通常在等電點(diǎn)的兩側(cè)，堿性蛋白如細(xì)胞色素C和溶菌酶選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白如肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶應(yīng)選在偏堿一側(cè)。③溫度：為防止活性蛋白變性、降解而失活，溫度通常選在5℃以下。對(duì)少數(shù)耐溫的蛋白質(zhì)和酶，可適當(dāng)提高溫度，使雜蛋白變性分離，有利于提純，如胃蛋白酶、酵母醇脫氫酶以及許多多肽激素可選擇37～50℃條件下提取，效果比低溫提取更好。醫(yī).學(xué) 全在.線提供www.med126.com
（2)有機(jī)溶劑提�。阂恍┎蝗苡谒⑾←}、稀酸或稀堿溶液的蛋白質(zhì)和酶，常用不同比例的有機(jī)溶劑來(lái)提取。如用70%～80%乙醇提取麩蛋白；用60%～70%的酸性乙醇提取胰島素，既可抑制水解酶對(duì)胰島素的破壞，又可除去大量雜蛋白，用丁醇提取某些附于微粒體和線粒體的酶，一些與脂質(zhì)結(jié)合牢固的蛋白質(zhì)和酶以丁醇提取，效果較好。我國(guó)生化工作者曾用此法成功地提取了琥珀酸脫氫酶和堿性磷酸脂酶。丁醇提取法對(duì)pH及溫度的選擇范圍較廣（Ph3～10),溫度由零下2℃～40℃均可。
2．核酸的提取 核酸分為兩大類：一類為核糖核酸（RNA)，另一類為脫氧核糖核酸（DND)。核酸的分子量極大，人數(shù)萬(wàn)致億萬(wàn)。核酸是兩性化合物，在一定的等電點(diǎn)。溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有機(jī)溶劑。細(xì)胞內(nèi)的核酸常和蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白。核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白在不同濃度的電解質(zhì)溶液中的溶解度有顯著區(qū)別，有一定濃度范圍的氯化鈉溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度隨著氯化鈉濃度增加而逐漸下降，當(dāng)氯化鈉濃度為0.14mol/L時(shí)，其溶解度僅為水中溶解度的1/100，但當(dāng)氯化鈉濃度再增加時(shí)，脫氧核糖核蛋白的溶解度重新增加，氯化鈉濃度增加到0.5mol/L時(shí)，其溶解度與水中溶解度相似，當(dāng)氯化鈉濃度增加到1mol/L時(shí)，它的溶解度比在水中大2倍。核糖核蛋白在0.14mol/L氯化鈉溶液中仍有相當(dāng)大的溶解度，因此常用0.14mol/L氯化鈉溶液提取核糖核蛋白，而提取脫氧核糖核蛋白時(shí)，則用1mol/L氯化鈉溶液。兩種核糖核蛋白的溶解度與溶液的pH也有關(guān)。當(dāng)pH為4.2時(shí)，脫氧糖核蛋白的溶解度最低，而pH為2.0～2.5時(shí)，核糖核蛋白的溶解度最低。所以調(diào)節(jié)氯化鈉溶液的濃度和pH值，可使核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白分離開來(lái)。
（1)RNA的提�。篟NA在細(xì)胞中主要有三種類型，即rRNA（核微粒核糖核酸)、tRNA（轉(zhuǎn)移核糖核酸)和mRNA（信使核糖核酸)。mRNA代謝極不穩(wěn)定，提取時(shí)要求條件較嚴(yán)格；tRNA當(dāng)細(xì)胞破碎后，用酸處理得到“pH5”沉淀，即可從中分離tRNA；rRNA占全部RNA的80%以上，比較穩(wěn)定，一般提取的大分子RNA主要為此部分。核內(nèi)rRNA常先將細(xì)胞核分離后，再進(jìn)行提取，可避免其他細(xì)胞組分RNA的干擾。
RNA的提取，通常是用0.14mol/L氯化鈉溶液將組織做勻漿并反復(fù)提取細(xì)胞質(zhì)中的核糖核蛋白，而留下含有DNA的細(xì)胞核物質(zhì)，然后用10%醋酸調(diào)至pH4.2沉淀，離心棄去上清液，先用0.5mol/L氯化鈉溶液，后用水洗滌沉淀，將核糖核蛋白后溶解于0.5mol/L碳酸氫鈉溶液中，離心，取上清液，調(diào)pH至4.2,沉淀以0.5mol/L氯化鈉溶液洗滌，再一次除去脫氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中的蛋白質(zhì)可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去，核酸留在碳酸氫鈉水溶液中，加入乙醇，RNA即以鈉鹽形式沉淀出來(lái)。
提取RNA另一類方法，不須事先用0.14mol/L氯化鈉提取核糖核蛋白，而一步將RNA的蛋白質(zhì)分開，并同時(shí)把RNA抽提出來(lái)，此類方法是在破碎細(xì)胞做成勻漿時(shí)，加入去污劑十二烷基磺酸鈉或二甲苯磺酸鈉；而現(xiàn)在最常用的方法是直接加入含水苯酚與勻漿一起振蕩，DNA和蛋白質(zhì)沉淀于酚層中，水層中含RNA和多糖，然后用乙醇使RNA沉淀，四種物質(zhì)一步便可初步分離開。苯酚法是目前提取不降解的RNA最有效的方法，其應(yīng)用舉例如下：
肝臟rRNA的提�。喊锤沃兀r)加入10倍容積苯酚-甲酚混合液（500g苯酚及70ml n-甲酚于50ml蒸餾水中，另加入0.5g 8-羥基喹啉配成)及10倍容積的0.5%萘-1，5-二磺酸水溶液（g/V)做勻漿后在20℃攪拌20min。
肝臟細(xì)胞核內(nèi)mRNA的提�。合确蛛x細(xì)胞核，再將核懸浮于3倍容積的0.5%pH6.5的萘二磺酸水溶液（g/V)中勻漿后加入等量90%（g/V)苯酚水溶液（內(nèi)含0.1%8-羥基喹啉)在2℃振蕩提取30min。
酵母tRNA的提�。�100g酵母（濕重)加入200ml水，300ml 90%苯酚水溶液，振蕩2h,4℃冰箱中過液，使之提取完全。
以上介紹了用冷酚法提取各種RNA的一些實(shí)例，近來(lái)還有皂土酚法（即除苯酚外還加入皂土吸附蛋白質(zhì))提取RNA，據(jù)報(bào)道比普通酚法提取RNA的生物活性高10倍左右。但應(yīng)用苯酚法提取核酸時(shí)，須注意市售苯酚常含有少量重金屬和雜質(zhì)，可能導(dǎo)致核酸降解，使用時(shí)，一般需要減壓重蒸。
�。�2)DNA的提�。篋NA主要存在于細(xì)胞核中，天然狀態(tài)的DNA絕大多數(shù)是以脫氧核糖核蛋白形式存在。人細(xì)胞中提取DNA時(shí)，一般先獲得脫氧核糖核蛋白，再將蛋白質(zhì)除去，從中分離DNA。常用的方法是以1mol/L氯化鈉溶液抽提，得到的脫氧核糖核蛋白溶液與含有少量辛酸或戊醇的氯仿一起振蕩，除去蛋白質(zhì)。或者在組織細(xì)胞破碎后以低濃度0.14mol/L氯化鈉溶液（也可用0.1mol/L氯化鈉加0.05mol/L檸檬酸代替)反復(fù)洗滌除去核糖核蛋白，再以1mol/L氯化鈉提取脫氧核糖核蛋白，提取仍按氧仿-戊醇抽提法除去蛋白質(zhì)。兩種方法比較，后一種方法使核酸降解可能少一些。以稀鹽溶液提取DNA時(shí)，加入適量去污劑更有助于蛋白質(zhì)與DNA的分離。
應(yīng)用苯酚法也可以提取DNA而且不用經(jīng)過脫氧核糖核蛋白這一步驟，例如大鼠肝勻漿在6%對(duì)氨基水楊酸鹽溶液內(nèi)，加入同體積90%苯酚水溶液，室溫下提取1h，再經(jīng)進(jìn)一步提純可獲得98%～99%純度的DNA。苯酚法也是目前提取DNA最常用的方法之一。
3．活性多肽及遞質(zhì)的提取大體上與蛋白質(zhì)的提取方法相似，可參照進(jìn)行。經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)如去甲腎上腺素、腎上腺素、乙酰膽堿、5-羥色胺等均可化學(xué)合成，無(wú)需用很多精力去提取。
