3．丙酮及醇類固定劑
系最初免疫細(xì)胞化學(xué)染色的固定劑，其作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖，對(duì)組織穿透性很強(qiáng)，保存抗原的免疫活性較好。但醇類對(duì)低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，解決的辦法是和其它試劑混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
�。�1)Clarke氏改良劑（100%酒精95ml，冰醋酸5ml)，用于冰凍切片的后固定。
�。�2)乙醚（或氯仿)與乙醇等量混合液。
Danos（1976)等認(rèn)為其組織穿透性極強(qiáng)，即使涂片上富于過多的粘液，固定效果仍然良好，是理想的細(xì)胞固定液。
（3)AAF液：95%-100%酒精85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10ml。
�。�4)Carnoy氏液：100%酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。C保存?zhèn)溆谩?/P>
（5)Methacarn氏液：甲醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。C保存?zhèn)溆谩?/P>
以上兩種固定液適宜某些抗原，癌基因蛋白產(chǎn)物檢測(cè)的 固定，P53抗癌基因蛋白產(chǎn)物，PC-NA等抗原的保存。
丙酮的組織穿透性和脫水性更強(qiáng)，常用于冰凍切片及細(xì)胞涂片的后固定，保存抗原性較好，平時(shí)4。C低溫保存?zhèn)溆�，臨用時(shí)，只需將涂片或冰凍切片插入冷丙酮內(nèi)5-10min，取出后自然干燥，貯存于低溫冰箱備用。
以上介紹了免疫組織化學(xué)中常用的固定液，用于免疫組化的固定劑種類很多（見附錄)，不同的抗原和標(biāo)本需經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，選用最佳固定液。不少學(xué)者認(rèn)為，迄今尚無一種標(biāo)準(zhǔn)固定液可以用于各種不同的抗原固定。而且同一固定液固定的組織，免疫組化染色標(biāo)記結(jié)果可截然不同，致使人們無所適從。選擇最佳固定液標(biāo)準(zhǔn)是：①最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。②最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金屬的固定液在免疫組化技術(shù)中是禁用的。實(shí)際經(jīng)驗(yàn)告訴我們，中性緩沖福爾馬林（或多聚甲醛)是適應(yīng)性較廣泛的固定液，但固定時(shí)間不宜過長(zhǎng)。必要時(shí)，可作多種固定液對(duì)比，從而選出理想的標(biāo)準(zhǔn)固定液。
固定組織時(shí)應(yīng)注意：①應(yīng)力求保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。②組織塊不易過大過厚，必須小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是組織塊厚度必須控制在0.3cm以內(nèi)。③固定液必須有足夠的量，在體積上一般大于組織20倍以上，否則組織中心固定不良影響效果。④組織固定后應(yīng)充分水洗，去除固定液造成的人為假象。
�。ㄈ�)固定方法
1．浸入法（Immersion method)
將組織浸泡在固定液內(nèi)，必要時(shí)可在低溫（4。C)環(huán)境下進(jìn)行，固定時(shí)間可根據(jù)抗原的穩(wěn)定性以及固定液性質(zhì)而定，一般在2-12h之間。
2．灌注法（Irrigation method)
此法適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。自左心室插入主動(dòng)脈，先以krebs或生理鹽水沖冼血液后，以泵、吊筒或50-100ml注射器注入固定液。置灌注動(dòng)物于4。C冰箱內(nèi)，次日取出腦組織或其它組織。外周組織一般在灌注后30min內(nèi)取材，取組織置同一固定劑中浸入1-3h，然后修整組織塊。有主張用冷固定劑（4。C)進(jìn)行灌注。我們的體會(huì)是一般光鏡下觀察的標(biāo)本，室溫固定即可獲滿意效果。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，保持組織新鮮是很重要的，據(jù)報(bào)告，肽類抗原活性在斷絕血液供應(yīng)后24h幾乎完全喪失。
灌注法固定可使固定液迅速達(dá)到全身各組織。達(dá)到充分固定之目的。灌注沖洗還能排除紅細(xì)胞內(nèi)假過氧化物酶的干擾。浸入法主要用于活檢和手術(shù)標(biāo)本，以及其它不能進(jìn)行灌注的組織固定。
三、組織切片技術(shù)
應(yīng)用于光鏡的免疫組織化學(xué)染色的切片厚度一般要求5μm左右，神經(jīng)組織的研究要求切片厚度在20-100μm，有利于追蹤神經(jīng)纖維的走行。
1．冰凍切片 是免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng)采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片。
冰凍時(shí)，組織中水份易形成冰晶，往往影響抗原定位。一般認(rèn)為冰晶少而大時(shí)，影響較小，冰晶小而多時(shí)，對(duì)組織結(jié)構(gòu)損害較大，在含水量較多的組織中上述現(xiàn)象更易發(fā)生。冰晶的大小與其生長(zhǎng)速率成正比，而與成核率（形成速率)成反比，即冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小，對(duì)組織結(jié)構(gòu)影響愈嚴(yán)重。因此，應(yīng)盡量降低冰晶的數(shù)量。Fish認(rèn)為冰凍開始時(shí)，冰晶成核率較慢，以后逐漸增加，其臨界溫度為-33。C,從-30。C降至-43。C之間，成核率急劇增加達(dá)1018，然后再減慢�；谏鲜隼碚摽刹扇∫韵麓胧p少冰晶的形成。
�。�1)速凍，使組織溫度驟降，縮短從-33。C43。C的時(shí)間，減少冰晶的形成。其方法有二：
①干冰-丙酮（酒精)法：將150-200ml丙酮（酒精)裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰，直至飽和呈粘稠狀，再加干冰不再昌泡時(shí)，溫度可達(dá)-70℃C，用一小燒杯（50-100ml)內(nèi)裝異戊烷約50ml，再將燒杯緩慢置入干冰丙酮（純酒精)飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度達(dá)-70℃時(shí)即可使用。將組織（大小為1cm×0.8cm×0.5cm)投入異戊烷內(nèi)速凍30-60s后取出，或置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-80℃低溫冰箱內(nèi)貯存。
�、谝旱ǎ簩⒔M織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm)，如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開始?xì)饣序v，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆�，或置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。
