有關細胞和組織學的技術

　�。�2)將組織置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量。

　　影響冰凍切片的因素較多，因此，技術難度較大，選擇好的冰凍切片機是保證切片質量的關鍵。目前冰凍切片機有兩類：

　　①恒慢冰凍切片機（Cryastat)：為較理想的冰凍切片機，型號很多，但其基本結構是將切片機置于-30℃C低溫密閉室內(nèi)，故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至2-4μm，完全能滿足免疫組織化學標記要求。切片時，低溫室內(nèi)溫度以-15℃～18℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。

　�、陂_放式冰凍切片機：包括半導體致冷切片機和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機。切片時暴露空氣中，溫度不易控制，切片技術難度大，在高溫季節(jié)　，切片更加困難，且切片厚8～15μm，不易連續(xù)切片，但其優(yōu)點是價廉，國內(nèi)有生產(chǎn)。

　　冰凍切片后如不染色，必須吹干，貯存低溫冰箱內(nèi)，或進行短暫預固定后貯存冰箱保存。

　　2．石蠟切片

　　其優(yōu)點是組織結構保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實用價值，能切連續(xù)薄片，組織結構清晰，抗原定位準確。用于免疫組化技術的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同：①脫水、透明等過程應在4℃。C下進行，以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小應限于2cm×1.5cm×0.2cm，使組織充分脫水、透明、浸蠟。③浸蠟、包埋過程中，石蠟應保持在60℃以下，以溶點低的軟蠟最好（即低溫石蠟包埋)。

　　組織塊脫水、透明、浸蠟時間參考表1-3：

表 1-3 組織塊處理時間表

　　以上全過程為18-24h，也可在室溫內(nèi)使用自動脫水機代替。如組織塊小，直徑小于0.5cm，可用快速石蠟包埋切片，全過程只需4h左右。

　　石蠟切片為常規(guī)制片技術，切片機多為輪轉式，切片厚度2～7μm，應用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致。由于甲醛固定、有機熔劑和包埋劑對組抗原有一定的損害及遮蔽，使抗原特征發(fā)生改變。有人報告經(jīng)蛋白酶消化，可以改善光鏡免疫組化染色強度，常用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蠟切片應入37℃恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長期貯存，可存放于4℃冰箱內(nèi)備用。

　　石蠟切片優(yōu)點較多，但在制片過程中要經(jīng)過酒精、二甲苯等有機溶劑處理，組織內(nèi)抗原活性失去較多，有人采用冷凍干燥包埋法（Freeze drying embedding methed)，可以保存組織內(nèi)可溶性物質，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。該法是將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機（Freezing dryer)在真空、低溫條件下排除組織內(nèi)水分 ，然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織，最后將組織浸蠟、包埋、切片。此法可用于免疫熒光標記、免疫酶標記及放射自顯影。

　　3．振動切片　 用振動切片機（Vibratotme)，可以把新鮮組織（不固定不冰凍)切成厚片20～100μm，以漂浮法在反應板進行免疫組織化學染色，然后在解剖顯微鏡下檢出免疫反應陽性部位，修整組織進行后固定，最后按電鏡樣品制備、脫水、包埋、超薄切片、染色觀察等。組織不冰凍，無冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對抗原的損害，能較好地保留組織內(nèi)脂溶性物質和細胞膜抗原，主要用于顯示神經(jīng)系統(tǒng)抗原分布研究。這種包埋前染色，尤其實用于免疫電鏡觀察。

　　4．塑料切片

　　塑料包埋切片常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類（Glycol methacrylate, GMA)及環(huán)氧樹脂類（Epon 812,618)，其優(yōu)點是可以同時作光鏡和電鏡檢測，能相互對照所查抗原，定位準確。塑料包埋切片可切出比石蠟切片更薄的切片，光鏡切片可薄至0.5～2um，故稱半薄切片（Semithin section)。GMA保存抗原較好，不與組織產(chǎn)生共聚合，但形態(tài)學結構欠佳。環(huán)氧樹脂如Fpon和Araldite能較好地保存形態(tài)學結構，但在聚合過程中易和組織起作用，改變抗原結構。塑料包埋切片由于處理程序繁多，抗原活性易丟失。同時半薄切片進行免疫染色時，抗血清不易穿透樹脂，因此，塑料切片主要用于免疫電鏡的超微切片前定位。包埋前染色的標本，切片薄切片后不需染色，直接在相差顯微鏡下觀察免疫反應部位呈黑點狀，定位后進一步作超薄切片，這樣，可以明顯提高免疫電鏡陽性檢出率。

　　5．超薄切片

　　電鏡標本制作見第七章　，應用超薄切片機（Ultrotome)進行切片。

　　6．碳蠟切片

　　碳蠟（Carbowax)，學名聚乙烯二醇（Polyethlene glycol, PEG)為水溶性蠟。根據(jù)其分子量不同，碳蠟有多種，如400、800、1000、1500、4000、6000等，用于組織包埋的有1500、4000兩種，其熔點分別38℃C和52。C左右，常溫下為固體石蠟狀，加溫熔化呈液體狀。

　　本法的特點是組織固定水洗后，不需脫水透明可直接浸蠟包埋，且切片方法與常規(guī)石蠟切片相同。切下的組織片漂浮水面后自然展開，碳虹迅速深化，組織片即可展平，制片過程簡單易行。

　　具體操作簡述如下：組織塊不宜過大，一般限定在1.5cm×1cm×0.1cm以內(nèi)。①組織固定后充分水洗去除固定液，用濾紙吸干組織表面水。②將組織浸入碳蠟（1500)內(nèi)，45℃30min。③再次浸入混合混合碳蠟液（1500和4000等量混合液)，52℃30min。④浸入等量混合碳蠟液（或根據(jù)氣溫、濕度變化調整4000和5000混合比例，如氣溫高濕度大可以4000：1500=3：2混合，反之，則2：3混合)。⑤用等量混合碳蠟或調整混合碳蠟包埋成組織蠟塊。⑥切片與石蠟切片相同。在操作過程中，碳蠟組織塊應盡量避免與水或冰接觸，貯存時應密封干燥冷藏。

　　本法優(yōu)點是操作程序減少，時間縮短，組織不經(jīng)有機溶劑損害、溫度低、抗原性保存比石蠟切片好，組織結構清晰。缺點是夏季室溫高時切片較困難，連續(xù)切片不如石蠟切片順利；由于碳蠟有強吸濕性，不易長期保存。

　　7．玻片處理和涂膠

　　在免疫組化染色過程中由于各種原因常造成標本（細胞制片和組織切片)脫片現(xiàn)象，影響了工作質量和速度。一般采取兩種方法即可防止脫片現(xiàn)象出現(xiàn)。

　�。�1)載玻片和蓋玻片處理：新載玻片上有油污，必須經(jīng)過清潔液浸泡12～24h，流水充分漂洗后用蒸餾水清洗5遍以上，浸泡在95%酒精內(nèi)2h，用綢布擦干或用紅外線烤箱烤干均可，貯放于玻片盒內(nèi)備用。蓋玻片很薄，以上處理程序必須縮短，清潔液浸泡只需2h，流水沖洗注意勿損傷玻片等。

　�。�2)載玻片上涂粘附劑：粘附劑種類較多，常用的有以上幾種：①樹脂膠（Resin glue)又稱白色乳膠，為木工用，有進口，國產(chǎn)之分，有人認為進口白色樹脂膠較穩(wěn)定，我們認為國產(chǎn)白乳膠（聚醋酸乙烯乳液J-北京產(chǎn))質量尚穩(wěn)定。使用濃度為1%～2%，以蒸餾水稀釋即可。②甘油明膠，混勻后涂在載玻片上，切片貼附后置有副醛的干燥器內(nèi)，加熱80℃1h。③甲醛明膠， 混合后即可涂片。④鉻明礬明膠， 混合后即可涂片，置37℃溫箱烤干。⑤多聚賴氨酸液：多聚賴氨酸0.1g，加蒸餾水10ml，混合后即可涂片。此液不宜多配制。⑥3-Amino propy Eri-ethoxy Silame（APES)。

　　粘附劑2～5配制法見附錄一。

上一頁  [1] [2] [3] [4] [5] 下一頁