實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué):第一節(jié)　無(wú)菌動(dòng)物

一、無(wú)菌動(dòng)物的基本概念

所謂無(wú)菌動(dòng)物，就是指不能檢出任何活的微生物和寄生蟲(chóng)的動(dòng)物。從微生物學(xué)的觀點(diǎn)看，通常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體內(nèi)和體外帶有寄生蟲(chóng)，體內(nèi)還常帶有細(xì)菌和病毒，而且還都難于排除某些潛在的傳染病。此外，普通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血清中含有抗體。所以用并存普通動(dòng)物進(jìn)行醫(yī)學(xué)科學(xué)研究，將會(huì)存在各種各樣的干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往不確切。使用無(wú)菌動(dòng)物作實(shí)驗(yàn)就可以克服普通實(shí)驗(yàn)所存在缺點(diǎn)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果正確可靠。

無(wú)菌動(dòng)物是在無(wú)菌屏障系統(tǒng)中，剖腹取出胎兒，飼養(yǎng)繁育在無(wú)菌隔離器中，飼料、飲水經(jīng)過(guò)消毒，定期檢驗(yàn)，證明動(dòng)物體內(nèi)外均無(wú)一切微生物和寄生蟲(chóng)（包括大部分病毒)的動(dòng)物。無(wú)菌動(dòng)物的“菌”主要是指細(xì)菌，而嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，還包括真菌、立克次氏體、支原體和病毒等微生物及各種寄生蟲(chóng)。而所謂“無(wú)”卻不是絕對(duì)的，不過(guò)是根據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)知識(shí)和檢查方法在一定時(shí)期內(nèi)不能檢出已知的微生物和寄生蟲(chóng)而已。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在認(rèn)為是無(wú)菌的動(dòng)物或許將來(lái)可以檢出微生物和寄生蟲(chóng)而不是無(wú)菌動(dòng)物，因?yàn)檫@個(gè)“無(wú)”是相對(duì)而言的。到目前為至，尚未確立無(wú)菌動(dòng)物的微生物檢定法，因此，研究者的檢定方法各式各樣，其中病毒和立克氏體的檢查尚有相當(dāng)多的問(wèn)題。例如，在無(wú)菌動(dòng)物中供實(shí)驗(yàn)室使用最多的無(wú)菌小鼠，用電子顯微鏡檢查證明，胸腺細(xì)胞中仍有存在白血病病毒的例子，因而，現(xiàn)在的所謂無(wú)菌動(dòng)物，指動(dòng)物體內(nèi)外未能檢出細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)、內(nèi)外寄生蟲(chóng)的動(dòng)物較妥當(dāng)。

用大量抗菌素也可以使普通動(dòng)物暫時(shí)無(wú)菌，但是這種動(dòng)物不是無(wú)菌動(dòng)物。因?yàn)檫@種無(wú)菌狀態(tài)往往是一過(guò)性的，某些殘存的細(xì)菌在適當(dāng)?shù)臈l件下又會(huì)在體內(nèi)增殖；即使能把體內(nèi)細(xì)菌全部殺死，它們給動(dòng)物造成的影響卻是無(wú)法消除的，例如：特異性抗體的存在、網(wǎng)狀內(nèi)皮膚系統(tǒng)的活化、某些組織或器官的病理變化等。因此，無(wú)菌動(dòng)物必須是生來(lái)就無(wú)菌的動(dòng)物。

按對(duì)微生物的控制的程度，可以將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四類(lèi)：即（１)無(wú)菌動(dòng)物（Germ　Free,GF)；（２)悉生動(dòng)物或已知菌動(dòng)物（Gnotobiotics,GN)；（３)無(wú)特定病原體動(dòng)物（Specific　Pathogen　Free,SPF)；（４)通常動(dòng)物（Conventional,CV)。無(wú)菌動(dòng)物和悉生動(dòng)物飼養(yǎng)于隔離器中（隔離系統(tǒng))，無(wú)特殊病原體動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)，通常動(dòng)物飼養(yǎng)于開(kāi)放系統(tǒng)。

通常動(dòng)物是在開(kāi)放系統(tǒng)條件下飼養(yǎng)的，都受到自然界微生物和寄生蟲(chóng)的侵襲，一般都帶細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)。有的動(dòng)物外觀看起來(lái)健康，其實(shí)都隱藏著某些疾病或有微生物與寄生蟲(chóng)的感染。因此用通常動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)敏感性差、反應(yīng)性不一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏再現(xiàn)性。要提高動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，就必須對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在遺傳和微生物兩個(gè)方面加以控制，培養(yǎng)出標(biāo)準(zhǔn)的合格動(dòng)物，才能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果正確可靠，達(dá)到反應(yīng)均一性和重復(fù)性。采用兄妹間近親交配殖繁20代以上所培育的近交系動(dòng)物，遺傳均一、個(gè)體差異小、實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較準(zhǔn)確。但是只從遺傳上加以控制，如不進(jìn)行微生物控制，沒(méi)有排除自然感染的微生物和寄生蟲(chóng)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍可能不準(zhǔn)確。因此，在精度要求高的實(shí)驗(yàn)中，無(wú)菌動(dòng)物、悉生動(dòng)物和無(wú)特殊病原體動(dòng)物就成了理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

表6－1　按微生物控制程度的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分類(lèi)原則

二、無(wú)菌動(dòng)物的發(fā)展

無(wú)菌動(dòng)物的產(chǎn)生和發(fā)展，已有近百年的歷史，許多學(xué)者曾對(duì)肖椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的無(wú)菌狀態(tài)進(jìn)行過(guò)反復(fù)的研究。無(wú)菌動(dòng)物的研究，起源于19世紀(jì)后期，1885-1886年間，確立了在動(dòng)物體內(nèi)沒(méi)有微生物也能生存的概念。1885年，Dudeaux曾將豌豆在無(wú)菌條件下進(jìn)行栽培，證明無(wú)菌植物不能利用供給的養(yǎng)分。同年P(guān)asteur認(rèn)為，動(dòng)物在沒(méi)有腸道細(xì)菌參與條件下不能生存。1886年Neucki提出相反的看法，認(rèn)為細(xì)菌對(duì)于動(dòng)物的生存不是必需的。因此展開(kāi)了一場(chǎng)爭(zhēng)論。約10年后，1895年Kijanizin在無(wú)菌代謝試驗(yàn)籠內(nèi)飼養(yǎng)兔，給予無(wú)菌空氣、飼料和水，兔的體重逐漸下降，并因負(fù)氮平衡而死亡。同年Nuttall和Thierfelder經(jīng)剖腹產(chǎn)獲得豚鼠，飼養(yǎng)于玻璃罩內(nèi)，每小時(shí)人工哺以滅菌牛奶和純動(dòng)物性飼料一次，共計(jì)8天，動(dòng)物外觀健康，將此動(dòng)物于第8天處死，其腸內(nèi)容物沒(méi)有檢出細(xì)菌。1914年Cohendy也曾飼養(yǎng)過(guò)無(wú)菌豚鼠，但是沒(méi)有獲得成功。14年后Glimstedt繼續(xù)開(kāi)展無(wú)菌豚鼠的研究，于1932年，終于把無(wú)菌豚鼠養(yǎng)活兩個(gè)月，取得了初步進(jìn)展，至1959年Teah在Notre　Dame大學(xué)已能使無(wú)菌豚鼠繁殖。

關(guān)于無(wú)菌雞的培育，早在1897年Schottelius就曾獲得，但沒(méi)有繼續(xù)養(yǎng)活。1908年Cohendy育成無(wú)菌雞，且生長(zhǎng)情況良好。1935年Kimura，Naito和Kobayashi在日本京都大學(xué)飼養(yǎng)了無(wú)菌雞。1944年Luckey和Lakey又開(kāi)始進(jìn)行無(wú)菌雞飼料營(yíng)養(yǎng)的研究。1948年美國(guó)Lobund小組飼養(yǎng)的無(wú)菌雞，成長(zhǎng)后第一次產(chǎn)卵，并孵化出新的一代，從此飼養(yǎng)無(wú)菌雞獲得完全的成功。

由于1922年Baeot和Harden發(fā)現(xiàn)無(wú)菌蠅蛆必須飼喂B族維生素才能正常生長(zhǎng)，證明了無(wú)菌動(dòng)物對(duì)B族維生素的需要，因?yàn)闊o(wú)菌動(dòng)物腸內(nèi)沒(méi)有細(xì)菌存在，自身不能合成B族維生素，從而找到了過(guò)去的飼養(yǎng)無(wú)菌動(dòng)物失敗的原因。1937年Balzam在無(wú)菌雞的維生素B族缺乏癥及在雞體內(nèi)能否合成B族維生素的研究中，更加清楚地證明了這個(gè)問(wèn)題。無(wú)菌動(dòng)物對(duì)B族維生素需要的發(fā)現(xiàn)是很有價(jià)值的，它推動(dòng)了無(wú)菌動(dòng)物培養(yǎng)工作的發(fā)展，并使之走向成功。

第一個(gè)無(wú)菌大白鼠群是美國(guó)Lobund小組于1951年建立的。第二個(gè)無(wú)菌大白鼠群是Gustafsson于1956年在瑞典建成。1959年Reyniers在Tempa大學(xué)建立無(wú)菌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。印度的無(wú)菌動(dòng)物群于1959年在印度大學(xué)醫(yī)學(xué)中心建立。

隨著無(wú)菌動(dòng)物研究的開(kāi)展，無(wú)菌動(dòng)物的飼養(yǎng)裝置也不斷地改進(jìn)。1915年德國(guó)的科斯特首次創(chuàng)造無(wú)菌動(dòng)物培育隔離器。1928年美國(guó)圣母大學(xué)細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Reyniers創(chuàng)造了不銹鋼制的無(wú)菌動(dòng)物大型隔離器。從此開(kāi)展了無(wú)菌動(dòng)物的系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)�，F(xiàn)在美國(guó)有48個(gè)無(wú)菌動(dòng)物研究單位，僅國(guó)立衛(wèi)生研究院的5個(gè)研究所里，就分別設(shè)有無(wú)菌動(dòng)物研究室。1930年Gustafsson設(shè)計(jì)了第二型隔離器，整個(gè)隔離器的原料是不銹鋼的。在日本，自1946年開(kāi)始培育無(wú)菌動(dòng)物，1959年宮川用不銹鋼做隔離器的主體部分，并附有小的玻璃觀察窗和靈敏的機(jī)械手，使不銹鋼隔離器達(dá)到比較完善的地步。但這種隔離器既笨重造價(jià)又昂貴，不可能大量推廣使用，因而也限制了無(wú)菌動(dòng)物工作的開(kāi)展。在日本現(xiàn)有24個(gè)單位從事無(wú)菌動(dòng)物研究工作，僅在東京就有9個(gè)無(wú)菌動(dòng)物研究單位。50年代，發(fā)明了用過(guò)氧乙酸進(jìn)行表面滅菌的方法以后，1957年P(guān).C.Trexler在美國(guó)印第安那州圣母大學(xué)Lobund研究室里創(chuàng)造了塑料膜隔離器，用無(wú)毒聚氯乙烯薄膜制造隔離器的主體部分。由于這類(lèi)隔離器制作方便，既輕便又實(shí)用，所需用費(fèi)用又不高，僅為不銹鋼隔離器的幾十分之一，滅菌方法也大為簡(jiǎn)便，因此日漸廣泛地得到應(yīng)用，促進(jìn)了無(wú)菌動(dòng)物研究的發(fā)展。

1978年Lobund研究室的Morris　Pollard博士來(lái)華講學(xué)時(shí)給我國(guó)贈(zèng)送了一具Trexler隔離器，中國(guó)醫(yī)科院動(dòng)物中心已仿制成功，上海、蘇州等地也已制作成功，并已小批量生產(chǎn)。近二年來(lái)，Trexler教授親自來(lái)華講學(xué)，傳授隔離器和無(wú)菌動(dòng)物飼養(yǎng)繁殖技術(shù)，促進(jìn)了我國(guó)無(wú)菌動(dòng)物研究的發(fā)展。現(xiàn)在北京、上海等地已有幾個(gè)單位在研究無(wú)菌動(dòng)物。

此外，澳大利亞、比利時(shí)、西德、蘇聯(lián)、捷克、英國(guó)、法國(guó)、意大利等國(guó)和地區(qū)，都已建立了包括無(wú)菌動(dòng)物在內(nèi)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

對(duì)無(wú)菌動(dòng)物的研究最初只是為了探討高等動(dòng)物與體內(nèi)微生物之間的關(guān)系。19世紀(jì)末,Nattal氏及Thierfelder氏用剖腹術(shù)取出了妊娠豚鼠的胎兒，在無(wú)菌環(huán)境下飼養(yǎng)了10天。隨后，Schettelus發(fā)現(xiàn)雞的胚胎是無(wú)菌的，后來(lái)成功地進(jìn)行了雛雞的無(wú)菌化。無(wú)菌動(dòng)物所具有的獨(dú)特優(yōu)越性使其成為一種新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。隨著生物學(xué)的進(jìn)步和技術(shù)的發(fā)展，試行了各種動(dòng)物的無(wú)菌化，現(xiàn)在無(wú)菌動(dòng)物的品種已經(jīng)很多，不僅小鼠、大鼠、豚鼠和家兔等小動(dòng)物已有無(wú)菌動(dòng)物，而且狗、貓、猴、豬、山羊、綿羊和牛等大動(dòng)物以及雞、火雞、鵪鶉、青蛙、蛇甚至蠶、蒼蠅、白蟻等也都有了無(wú)菌動(dòng)物。這些都是為了適應(yīng)科學(xué)發(fā)展的需要而培育的，其中的小鼠、大鼠、豚鼠，國(guó)外一些發(fā)達(dá)國(guó)家已能大量生產(chǎn)，并比較方便地應(yīng)用于日常研究中了。已育成的無(wú)菌動(dòng)物見(jiàn)表6-2。

表6-2　已育成的無(wú)菌動(dòng)物

三、無(wú)菌動(dòng)物的特征

只要飼料配備適當(dāng)，無(wú)菌動(dòng)物發(fā)育正常，外觀和普通動(dòng)物相同，但是其機(jī)能、結(jié)構(gòu)和普通動(dòng)物有很大的不同。無(wú)菌動(dòng)物受兩個(gè)因素影響，即微生物和因飼養(yǎng)比較聚集而致的腎上腺增大。

無(wú)菌動(dòng)物的特征主要反映在下面二個(gè)方面

（一)形態(tài)學(xué)改變

1．消化系統(tǒng)：主要變化在腸道

⑴無(wú)菌動(dòng)物腸道肌層薄，更為特異的是盲腸肥大，比普通動(dòng)物要大5-6倍。無(wú)菌豚鼠的盲腸可達(dá)體重的1/3。主要是由于腸壁薄、張力低而增大。由于盲腸膨大，腸壁菲薄，常因盲腸扭轉(zhuǎn)或腸壁破裂而死亡。如給無(wú)菌動(dòng)物注入梭狀芽孢桿菌則可縮小盲腸體積。

⑵腸粘膜絨毛增多。

⑶肝臟重量下降。

2．循環(huán)系統(tǒng)：心臟相對(duì)縮小。

3．血液系統(tǒng)：白細(xì)胞增加。普通動(dòng)物白細(xì)胞總數(shù)波動(dòng)范圍大，無(wú)菌動(dòng)物白細(xì)胞數(shù)值恒定。

4．網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)：脾臟縮小，無(wú)三級(jí)濾泡，網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞功能降低。

（二)生理學(xué)改變

1．免疫功能：由于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、淋巴組織發(fā)育不良，淋巴小結(jié)內(nèi)缺乏生發(fā)中心，產(chǎn)生丙種球蛋白的能力很弱（在檢查無(wú)菌動(dòng)物的無(wú)菌性時(shí)，血清丙種球蛋白陰性可以作為無(wú)菌的一個(gè)輔助證據(jù))，又因?yàn)轶w內(nèi)無(wú)微生物和寄生蟲(chóng)，血中無(wú)抗體，血清殺菌力低，吞噬細(xì)胞噬菌力也低，因此對(duì)微生物感染異常敏感，某些病原性弱和必須經(jīng)腹腔或顱腦接種才能感染普通動(dòng)物的微生物很容易感染無(wú)菌動(dòng)物。

2．生長(zhǎng)率：無(wú)菌條件下對(duì)不同種屬影響不同。無(wú)菌鳥(niǎo)類(lèi)生長(zhǎng)率高于同種的普通鳥(niǎo)類(lèi)；無(wú)菌大小鼠與普通鼠差不多；無(wú)菌豚鼠和無(wú)菌兔生長(zhǎng)率比普通者慢。因腸內(nèi)無(wú)菌，不能幫助消化纖維素以提供機(jī)體所需要的營(yíng)養(yǎng)。

3．生殖：無(wú)菌條件對(duì)動(dòng)物的生殖影響不大。大鼠和小鼠因出生無(wú)感染身體較好；無(wú)菌豚鼠及兔比普通者繁殖力低，可能因大盲腸之故。

4．代謝：血中含氮量少，腸管對(duì)水的吸收率低，代謝周期比普通動(dòng)物長(zhǎng)。

5．營(yíng)養(yǎng)：與動(dòng)物品種有關(guān)，豚鼠和兔的腸道長(zhǎng)，故有影響。無(wú)菌動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞更新率比一般動(dòng)物低，腸壁的物質(zhì)交換也較慢。無(wú)菌條件下的各種動(dòng)物通過(guò)膽汁排泄代謝產(chǎn)物的速率均減慢；如切除無(wú)菌動(dòng)物的盲腸，則無(wú)菌動(dòng)物與普通動(dòng)物的差異縮小。無(wú)菌豚鼠和無(wú)菌兔在切除盲腸后，其生殖率增加。關(guān)于盲腸增大的原因，曾進(jìn)行過(guò)許多研究，尚無(wú)明確結(jié)果。推測(cè)可能是因?yàn)轱暳现械挠卸疚镔|(zhì)刺激盲腸，使其增大加長(zhǎng)、彈性減少。正常情況下飼料中的毒性物質(zhì)可被腸道菌分解。無(wú)菌條件對(duì)兔及豚鼠的盲腸產(chǎn)生的影響最大，Sabourdy曾稱(chēng)量過(guò)無(wú)菌豚鼠的盲腸（連同腸內(nèi)容物)，結(jié)果盲腸相當(dāng)于豚鼠體重的1/3。

6．壽命：無(wú)菌大鼠和小鼠比普通者長(zhǎng)壽。

四、無(wú)菌動(dòng)物技術(shù)

無(wú)菌動(dòng)物在自然界并不存，必須用人為的方法養(yǎng)育而成。一般將臨產(chǎn)前的健康動(dòng)物用麻醉藥品或拉斷頸椎處死后，立即浸泡在37℃滅菌液中，送進(jìn)無(wú)菌室（或無(wú)菌隔離器)，按無(wú)菌手術(shù)進(jìn)行剖腹，切除帶胎子宮（子宮內(nèi)首先應(yīng)無(wú)菌)，將其浸入消毒液里并立即輸送到另一只隔離器中，切開(kāi)子宮取胎，經(jīng)用滅菌紗布揩拭仔體并斷臍（電刀切斷)后，放入隔離器內(nèi)人工喂乳或用其他品系的無(wú)菌雌鼠作保姆代養(yǎng)。象小鼠和大鼠等用人工喂乳非常麻煩，故采用保姆代養(yǎng)。而象豚鼠因在一定程度上能自力飲乳，故人工哺乳較容易。另外，象禽類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)類(lèi)等，因是在卵中無(wú)菌的前提下作出的，故用藥物將卵周?chē)鷾缇�后移入滅菌隔離器內(nèi)使其孵化即可，而且，這些動(dòng)物，一般在出生后就能自力采食，故較易育成。

無(wú)菌動(dòng)物的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)在于胎盤(pán)屏障和屏障觀念，根據(jù)這個(gè)基礎(chǔ)開(kāi)展了無(wú)菌動(dòng)物工作。在無(wú)菌條件下取仔，一切操作在無(wú)菌隔離器內(nèi)進(jìn)行。

（一)哺乳類(lèi)無(wú)菌動(dòng)物技術(shù)

小動(dòng)物作子宮切除術(shù)（Hysterectomy)；大動(dòng)物做子宮切開(kāi)術(shù)（Hysterotomy)獲得幼仔。子宮切開(kāi)對(duì)兔子可用三次，但易污染，不如子宮切除術(shù)取仔安全。大動(dòng)物主要從經(jīng)濟(jì)角度考慮，采用子宮切開(kāi)取仔術(shù)。取仔程序如下：

1．腹部剃毛或用硫化鈉脫毛劑脫毛。

脫毛劑配制：

硫化鋇　50克

濕潤(rùn)劑　4克

甘油10克

水50毫升

作成類(lèi)糊狀用以脫毛。

2．處死妊娠雌鼠。一般不用化學(xué)藥品處死，以兔影響胎鼠。如用化學(xué)藥品時(shí)，應(yīng)使劑量對(duì)胎體無(wú)影響時(shí)方可使用。一般對(duì)小鼠用斷頸髓處死。較大的動(dòng)物如豚鼠用氟烷（Halothane　Oxygen)吸入麻醉，不用乙醚麻醉。

3．處死的雌鼠浸泡于37℃滅菌液中2分鐘。滅菌液配制：

福爾馬林20%

季銨5%

芐烷氨水75%

4．將妊娠鼠固定住，并于腹部粘上滅菌膠布。

5．剖腹。

6．取出子宮：

⑴將子宮放入滅菌液中，之后將盛子宮的小筐遞到另一隔離器中取胎鼠。這樣，在隔離器中有充分的時(shí)間檢查其是否污染。

⑵如將子宮直接在無(wú)特定病原體條件下取胎和飼養(yǎng)則有危險(xiǎn)，可能受染而無(wú)機(jī)會(huì)觀察。

7．用剪刀剪開(kāi)子宮壁，取出胎鼠，輕按以幫助呼吸，不立即斷臍，待呼吸正常時(shí)再用電刀切斷臍帶。

8．分開(kāi)胎盤(pán)，將取出的幼仔放到代乳母鼠身邊，把代乳母鼠的幼仔取出與剖腹產(chǎn)取出的幼鼠接觸，使之有同樣的氣味，便于代養(yǎng)。

9．剖腹取胎的時(shí)限。

⑴小鼠、大�。�9-10分鐘；

⑵豚鼠：5分鐘，因豚鼠耐缺氧能力低弱。

乳汁制備：首先用擠奶機(jī)獲得兔奶，冷凍干燥，經(jīng)γ射線消毒，保存于塑料袋中，貯放在隔離器內(nèi)。需用時(shí)將奶粉加水恢復(fù)干燥前的濃度，不加維生素和其他成份。須注意人工喂養(yǎng)經(jīng)常出現(xiàn)因灌喂入肺而致死。家兔3次/日，后來(lái)發(fā)現(xiàn)1次/日即可。根據(jù)家兔年齡及體重考慮每?jī)扇占恿?次。第1天喂5毫升，可維持1次/日；以后逐漸增加到4-5次/日；第3周時(shí)即可吃飼料。

自1958年以來(lái)，小鼠不用人工喂養(yǎng)。Sabourdy開(kāi)始培育無(wú)菌小鼠時(shí)，每天喂5次，有時(shí)半夜去喂小鼠，實(shí)際上無(wú)此必要。自廣泛使用隔離器后，都靠代乳鼠喂養(yǎng)。Sabourdy還認(rèn)為中國(guó)如開(kāi)始培育無(wú)菌動(dòng)物工作，不必采用人工喂養(yǎng)，因現(xiàn)在各國(guó)有許多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心有無(wú)菌動(dòng)物，運(yùn)輸也方便，可以從他的或別的實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)代乳鼠。

代乳鼠的最適期：在隔離器中交配，約于部腹服胎前1-2天產(chǎn)仔。C3H和C57BL品系為常用的代乳鼠。用作手術(shù)取胎的母鼠最好不是第一胎的。一般用做交配的雄鼠下午時(shí)放入，第二天上午8時(shí)將雄鼠取出。做剖腹產(chǎn)需了解雌鼠的妊娠期。特種鼠的妊娠期取足月的。小鼠性周期為4天多，如用100只雌鼠交配，應(yīng)有25只雌鼠受孕，實(shí)際上若用10%已屬不錯(cuò)。如果10只雌鼠受乳，用Whitten氏反應(yīng)法，100只雌鼠可有30%受孕。

（二)鳥(niǎo)類(lèi)無(wú)菌動(dòng)物技術(shù)

常用鵪鶉，也用雞。研究營(yíng)養(yǎng)用無(wú)菌雞，要選育無(wú)白血病的雞群。飼養(yǎng)無(wú)菌雞比較容易。雛雞出殼即可啄食，不用人工喂飼。關(guān)鍵在于消毒卵殼，因卵殼不平，不易滅菌。首先選外殼干凈的受精卵。按以下程序進(jìn)行：

1．將受精卵放至濕潤(rùn)劑中。

2．再放入2%升汞中浸12分鐘。

3．將浸泡過(guò)的受精卵放入隔離器中孵育。

建立無(wú)白血病雞群無(wú)從母雞選起，用這種雞卵培育無(wú)菌雞。否則僅外殼消毒是消滅不了雞白血病病毒。

五、無(wú)菌動(dòng)物的飼料和飼育裝置

（一)無(wú)菌動(dòng)物的飼料

無(wú)菌動(dòng)物的飼料水必須符合下列要求：

1．沒(méi)有活的微生物和寄生蟲(chóng)或蟲(chóng)卵，因此，必須經(jīng)過(guò)充分的滅菌，一般多用高壓滅菌。有條件可用60鈷照射滅菌，效果好，而且營(yíng)養(yǎng)成份破壞少，保存時(shí)間長(zhǎng)。根據(jù)我們研究證明采用1.5-2.5Mrd60鈷γ線照射的飼料滅菌效果顯著，能保持無(wú)菌狀態(tài)達(dá)4個(gè)月以上；營(yíng)養(yǎng)成份破壞較高壓滅菌法顯著少，如維生素B243.7%、E17.5%、C8.5%、蛋白質(zhì)11%、胱氨酸17.5%、賴(lài)氨酸14等；飼喂LACA小鼠和裸鼠后效果良好。值得推廣應(yīng)用。

2．必須補(bǔ)充因高壓滅菌而破壞的營(yíng)養(yǎng)成份，如：維生素B1、維生素C、泛酸等。補(bǔ)充的營(yíng)養(yǎng)成份用濾菌器過(guò)濾后加入飼料或飲水中飼喂。為了減少營(yíng)養(yǎng)成份的破壞，最好用放射線滅菌或環(huán)氧乙烷滅菌法代替高壓滅菌法。

3．無(wú)菌動(dòng)物沒(méi)有腸道正常菌叢，飼料中還須補(bǔ)充這些細(xì)菌合成的營(yíng)養(yǎng)成份。

4．飼料的組成、形態(tài)和氣味等應(yīng)盡可能適合動(dòng)物的習(xí)性和嗜好。

（二)無(wú)菌動(dòng)物的飼育裝置

無(wú)菌動(dòng)物必須在與自然界微生物完全隔絕的無(wú)菌隔離器內(nèi)飼育。舊式的無(wú)菌隔離器是用不銹鋼等金屬材料制成的，內(nèi)部用高壓蒸氣消毒，由于成本高、操作不方便，現(xiàn)在已被塑料無(wú)菌隔離器所取代。塑料隔離器是用硬透明塑料制成的，內(nèi)部用過(guò)氧乙酸等消毒液噴霧消毒，由于成本低、便于觀察、操作方m.quanxiangyun.cn/pharm/便，目前已被廣泛采用。我國(guó)生產(chǎn)的塑料隔離器最近在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心已通過(guò)鑒定，并已成批生產(chǎn)。

無(wú)菌隔離器必須具備下面五個(gè)條件：

1．必須是一個(gè)對(duì)微生物密閉的容器，其內(nèi)部空間和內(nèi)容物能接受高壓蒸氣或化學(xué)藥品滅菌處理。

2．隔離器的空間以及內(nèi)容可隨時(shí)被觀察。

3．隔離器內(nèi)部應(yīng)隨時(shí)在視野下從外部進(jìn)行工作，但不破壞內(nèi)部的無(wú)菌環(huán)境。

4．必須裝置一個(gè)有內(nèi)外門(mén)的無(wú)菌通道，動(dòng)物或食物以及其它物品可以從外部無(wú)菌地輸送到隔離器內(nèi)部去，而不被壞內(nèi)部的無(wú)菌環(huán)境，送出時(shí)亦然。

5．必須裝置一個(gè)無(wú)菌進(jìn)行出氣系統(tǒng)，內(nèi)部保持適度的高氣壓。

塑料無(wú)菌隔離器的結(jié)構(gòu)模式見(jiàn)圖6-1。

圖６－１　塑料無(wú)菌隔離器

其形態(tài)大小因應(yīng)用的目的和動(dòng)物的品種、數(shù)量而異，一般大小為1.80米×0.65米×0.5米，但是結(jié)構(gòu)原理基本相同。大體上分為收容間、緩沖間和空氣交換裝置三部分。收容間有一個(gè)消毒藥液的噴霧孔（a)和一付密封在塑料板上的橡膠手套（b)，內(nèi)部各種操作都要通過(guò)手套進(jìn)行。手套是活動(dòng)的，可以更換，為延長(zhǎng)手套使用期限，手套外面加布手套。緩沖間（c)有兩個(gè)開(kāi)口和一個(gè)噴霧消毒藥液的孔（d)，動(dòng)物、飼料、飲水和各種用具都通過(guò)緩沖間出入，兩個(gè)開(kāi)口要交互打開(kāi)，以防空氣污染收容間�？諝饨粨Q裝置由空氣過(guò)濾器（e)和排氣閥（f)兩部分構(gòu)成，排氣閥能阻止空氣逆流，以防污染。內(nèi)部的氣壓應(yīng)比外部略高，以利于換氣。

六、無(wú)菌動(dòng)物的檢查

為了確認(rèn)無(wú)菌動(dòng)物的無(wú)菌狀態(tài)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染，必須定其進(jìn)行檢查。檢查材料以糞便為主，也可檢查飼料、飲水和鋪墊物等，或用消毒棉花擦拭隔離器內(nèi)面或?qū)��?dòng)物飲食器皿表面進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基可用牛肉浸液、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、血液瓊脂、馬鈴薯瓊脂或沙保弱氏瓊脂等，分別在20℃、37℃、55℃作好氣和厭氣性培養(yǎng)。同時(shí)還要進(jìn)行呼吸道支原體的檢查和各種寄生蟲(chóng)檢查，對(duì)于病毒，不可能一一進(jìn)行分離培養(yǎng)，一般是通過(guò)臨床觀察、細(xì)胞培養(yǎng)或病理組織學(xué)檢查作判定。

七、無(wú)菌動(dòng)物在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用