放射免疫分析法的建立

　　一、放射免疫分析的基本試劑

　�。ㄒ�)標準品

　　標準品是放射免疫分析法定量的依據(jù)，由于以標準品的量用來表示被涮物質(zhì)的量，故標準品與被測物質(zhì)應(yīng)當(dāng)化學(xué)結(jié)構(gòu)一致并具有相同免疫活性。標準品作為定量的基準。應(yīng)要求高度純化。標準品除含量應(yīng)具有準確性外，還應(yīng)具備穩(wěn)定性，即在合理的貯存條件下保持原來的特性。

　　按實驗要求，將標準品用緩沖液配成含不同劑量的標準溶液，用于制作標準曲線。

　�。ǘ�)標記物

　　標記抗原應(yīng)具備：①比放射性高，以保證方法的靈敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期盡可能長，標記一次可較長時間使用，這對來之不易的抗原尤其重要；④標記簡便、易防護。

　　要準確測量B與F的放射性，必須有足夠的放射性強度。所選用的標記抗原的量，在使用¹²⁵I時達5000～15000cpm。

　　（三)抗體

　　應(yīng)選擇特異性高、親和力強及滴度好的抗體，用于放射免疫測定。

　　根據(jù)稀釋曲線，選擇適當(dāng)?shù)南♂尪�，一般以結(jié)合率為50%作為抗血清的稀釋度。

　�。ㄋ�)B與F分離劑

　　以2%加膜活性炭溶液為例，2%加膜活性炭溶液的配制：

　　活性炭2g（杭州木材廠生產(chǎn)，森工牌732型)

　　右旋糖酐T₂₀0.2g

　　加0.1mol/L PB 至100ml

　　電磁攪拌1h，然后置于變通冰箱冰箱待用。

　　（五)緩沖液

　　放射免疫分析技術(shù)所用的緩沖液有多種，要通過實驗選用抗體和抗原結(jié)合最高的緩沖液。

　　目前最常用的緩沖液有下列幾種：①磷酸鹽緩沖液；②醋酸鹽緩沖液；③巴比妥緩沖液；④Tris –HCl緩沖液；⑤硼酸緩沖淮。其中以磷酸鹽緩沖液應(yīng)用最多。

　　在緩沖液中，除必須有弱酸及弱酸的鹽成分外，還應(yīng)根據(jù)不同檢測項目加入下列物質(zhì)：①保護蛋白：常用的有牛血清白蛋白或白明膠，濃度為0.1%～0.2%，用以降低試管對抗原的非特異性吸附。②防腐劑：多采用0.1%疊氮鈉、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制劑：如測定心鈉素等肽類激素時，要加入適量的抑肽酶，用以抑制血漿內(nèi)源性水解酶對待測物的降解；又如測定cAMP、cGMP時，需加入EDTA·2Na，抑制磷酸二酯酶的活性。④阻斷劑：在測定甲狀腺激素或測定某些甾體激素時，必須加阻斷劑，使和蛋白質(zhì)相結(jié)合的激素，變?yōu)橛坞x型。常用的阻斷劑有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水楊酸鈉、三氯醋酸鈉等。⑤載體蛋白：采用二抗作B與F分離劑時，要向反應(yīng)液中加入適量與第一抗體同種動物的正常血清。在測定不含有血漿蛋白的樣品時，用PEG沉淀劑分離B、F，必須加適量γ球蛋白或正常人混合血清。

　　在神經(jīng)肽的RIA時，常用PELH緩沖液，（按1000ml,pH7.6)：

　　0．1mol/l PB　　　　　　　　980.0ml

　　0.3mol/L EDTA·2Na　　　　　10.0ml

　　0.2%洗必泰溶液　　　　　　　10.0ml

　　溶菌酶　　　　　　　　　　　1.0g

　　二、加樣程序

　　由于抗原、標記抗原和抗體三者加樣次序不同，而出現(xiàn)兩種加樣程序，分述如下：

　　（一)平衡飽和加樣程序

　　1．基本原理所謂平衡飽和，是指抗原和抗體反應(yīng)達到再不結(jié)合，也不解離的平衡狀態(tài)，稱為飽和狀態(tài)，即平衡飽和。所以，有人稱此為飽和分析法。這意味著抗原或被測抗原、標記抗原、抗體三者一起溫育。

　　2．加樣程序一般先加標準物或被測樣品，再加抗血清，最后加標記物。這樣的順序是讓標準物或被測物與抗體有短暫的結(jié)合，提高抗原的競爭抑制能力。

　　在小分子半抗原的放射免疫分析中，標記抗原和未標記抗原與抗體結(jié)合的親合力常常是不相同的，前者比后者的親合力高。因此，上述加樣程序就更有必要，所以一般都采用先加標準物或樣品和抗血清，后加標記物。這樣測定也比較穩(wěn)定。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com

　　在大分子蛋白質(zhì)抗原的放射免疫分析中，如果是雙抗體分離法，抗原和標記抗原與抗體三者加樣，可不分先后，有的是標準物、標記物、抗血清的加樣順序，但一般習(xí)慣還是標準物或血樣、抗血清、標記物、然后混勻溫育24～48h，再加雙抗體，繼續(xù)溫育24h，使免疫反應(yīng)達到平衡。對一些多肽激素的放射免疫分析，應(yīng)用雙抗體分離法，其流程比較長，這樣的順序同樣可不分先后。

　　以大鼠垂體、下丘腦β-內(nèi)啡肽RIA測定程序為例：

　�。�1)加樣（單位μl；總反應(yīng)體積500μl)

　　（2)孵育：4℃，24h

　�。�3)分離B與F：每管加入2%加膜活性炭溶液300μl，搖勻，立即離心，去上清，測沉淀（F)的CPM數(shù)。

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