一、凝集素電鏡標(biāo)記技術(shù)
凝集素的特性及標(biāo)記原理詳見第五章 ，近年來，凝集素電鏡標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用日益廣泛，且獲得較為滿意的效果。凝集素電鏡標(biāo)記技術(shù)方法較多，常用的有凝集素—酶（常用為HRP)、凝集素—生物素—酶電鏡標(biāo)記技術(shù)�，F(xiàn)將凝集素—酶電鏡標(biāo)記技術(shù)（包埋前染色)簡介如下（Sterit 和Kreatzberg,1987)。
（1)固定：常用為PLP或多聚甲醛—戊二醛固定液。如為取腦組織，可將已藻注動(dòng)物在4℃過夜，次日取腦組織置0.1mol/L磷酸或二甲胂酸鈉緩沖液（含7.5%蔗糖)中漂洗。
（2)振動(dòng)切片機(jī)（Vibratome)切60μm的厚片。
�。�3)切片孵育在PBS（內(nèi)含0.1mol/l CaCl2、Mgcl2和MnCl2)10min（有作者主張此步可省略)。
�。�4)為增強(qiáng)細(xì)胞通透性，切片可孵育于含0.1%胰蛋白酶和0.1CaCl2水溶液中，pH7.8,37℃孵育30min。
（5)PBS洗3次，每次2min。
�。�6)凝集素—HRp 1：10 在PBS中（含0.1%Triton X--100)4℃過夜，最好不斷輕輕振蕩。
�。�7)PBS洗3次，每次2min。
�。�8)DAB-H2O2顯色。
�。�9)1%OSO4水溶液固定。
�。�10)系列酒精脫水，EPON包埋，切片。
�。�11)電鏡沿—鈾雙染觀察。
凝集素呈高電子密度常沉積在細(xì)胞膜上，易與電子染色相區(qū)別。
二、掃描免疫電鏡技術(shù)
掃描免疫電鏡技術(shù)可為研究細(xì)胞或組織表面的三維結(jié)構(gòu)與抗原組成的關(guān)系提供可能性。
�。ㄒ�)標(biāo)記物
應(yīng)用于掃描電鏡的標(biāo)記物應(yīng)能在掃描電鏡可分辨的范圍內(nèi)，并能對細(xì)胞或組織抗原有較好的定位能力。在選擇標(biāo)記物時(shí)應(yīng)根據(jù)研究目的而定，如標(biāo)記細(xì)胞等由于體積較大，可用體積大的標(biāo)記物；如鑒別陽性（標(biāo)記細(xì)胞)與陰性（未標(biāo)記細(xì)胞)，而要定位受體等則需選用較小的，易于辨認(rèn)的標(biāo)記物。
常用的標(biāo)記物為顆粒性標(biāo)記物。依其特性可分為：
1．蛋白類 如血藍(lán)蛋白、鐵蛋白等。
2．病原體類 如煙草花葉病毒、南方菜豆花葉病毒、噬菌體T4、大腸桿菌f2、噬菌體等。
3．金屬顆粒膠體金、免疫金銀標(biāo)記技術(shù)和同位素放射性自顯影的銀顆粒等。其中以金屬類顆粒標(biāo)記物應(yīng)用最為廣泛。最常用的是膠體金，膠體金商品提供的直徑從3～150nm不等，掃描免疫電鏡常用的金顆粒直徑在30～60nm左右為宜。由于金本身系重金屬，有較強(qiáng)的發(fā)射2次電子的作用，故不需噴鍍金屬膜，這是膠體金應(yīng)用于免疫掃描電鏡的標(biāo)記優(yōu)于其它標(biāo)記物之處。免疫金銀染色能加強(qiáng)細(xì)胞或組織表面金屬顆粒聚集的密度。金、銀粒在電鏡顯示為電子密度高，外形清晰的顆粒易于識(shí)別和定位。病原體標(biāo)記物主要利用其特異殊的外形和結(jié)構(gòu)以達(dá)到標(biāo)記定位的目的，如噬菌體T4形似星形的球拍，頭部大約100nm直徑，呈六角形星狀，尾長約100nm，由頸部與頭部相接；煙草花葉病毒為15×30nm的桿狀病毒，而南方菜豆花葉病毒是直徑25nm的園形顆粒，這些病原體的典型外形很易于辨認(rèn)。鐵蛋白由于含有致密的鐵離子核心具有較高的電子密度，從而達(dá)到標(biāo)記定位的目的。血蛋白是由海螺類軟體動(dòng)物中提取的多分子聚合物，其外形為35×50nm的柱狀體，多應(yīng)用于病毒研究，但也有利用血藍(lán)蛋白與過氧化物等的糖蛋白部份可與凝集素相結(jié)合的特性，進(jìn)行細(xì)胞膜受體的定位。
�。ǘ�)免疫標(biāo)記方法
金屬類標(biāo)記物的免疫標(biāo)記法同切片免疫染色，即將標(biāo)記物與抗體相結(jié)合，通過直接或間接法顯示抗原部位。膠體金可與蛋白A相結(jié)合后與IgG分子中的Fc 段相結(jié)合。哪與卵白素（a－vidin)相結(jié)合可與結(jié)合抗體的生物素（biotin)反應(yīng)。免疫金銀染色法在膠體金標(biāo)記后，再進(jìn)行銀液顯影。病毒（包括噬菌體)標(biāo)記物多采用不標(biāo)記抗體法，即搭橋法。此法的原理是采用同種動(dòng)物制備抗原的特異性抗體與標(biāo)記物抗體（例如兔抗A抗原與兔抗HRP)。再用另一種動(dòng)物制備第一種動(dòng)物血清抗體的抗體（例如羊抗兔IgG抗體)。利用后者為橋，把抗原的特異性抗體與抗標(biāo)記物抗體結(jié)合起來，后者再與標(biāo)記物結(jié)合，以達(dá)到定位抗原的目的，其基本原理與PAP法類同。病原體免疫標(biāo)記可不用標(biāo)記物顯示，而利用其形態(tài)學(xué)特征定位或采用抗原抗體凝集法，其基本原理是利用病毒或病毒抗原的特異性抗體在與相應(yīng)的抗原反應(yīng)后，使后者之間發(fā)生交聯(lián)而凝集，經(jīng)濃縮后用陰性染色法（負(fù)染)便可在電鏡下顯示定位部位。
�。ㄈ�)掃描免疫電鏡的具體操作步驟
1．標(biāo)本處理
（1)細(xì)胞懸液：用10ml PBS 內(nèi)含1mg/ml牛血清白蛋白（PBS—BSa )懸浮細(xì)胞，離心250g,5min×2。加入PBS—BSA 至105～106細(xì)胞/ml，振搖成單細(xì)胞懸液。BSA能減低生物標(biāo)本的非特異性吸附，但注意濃度應(yīng)適宜，過高會(huì)減弱特異性反應(yīng)。
�。�2)細(xì)胞附著于固體支持物：由于固定與免疫標(biāo)記的孵育過程會(huì)引起細(xì)胞凝集，妨礙細(xì)胞表面的暴露，而且反復(fù)的離心與懸浮會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表面形態(tài)的改變。因此，通常將懸液中的細(xì)胞粘附于過濾膜或涂有帶正電荷聚合物的蓋玻片上，在粘附之前可依（1)法清洗標(biāo)本，以除去細(xì)胞表面的附著物。固體支持物可用涂有多聚—L—賴氨酸薄膜的載片或直徑13nm、孔徑0.22或0.45μm的過濾膜，載片制備方法：多聚—L—賴氨酸（Sigma)100μg/ml重蒸溶解涂抹于載片上，4℃30min后傾倒掉表面液體，令其自然干燥。注意載玻片事先需要清潔液浸泡，水漂洗過夜，然后浸泡于乙醇或丙醇中，用前取出自然干燥或用綢巾拭干。將細(xì)胞懸液（如細(xì)胞數(shù)少可事先離心，取沉淀細(xì)胞)，滴于濾膜或載片上，由于多聚賴氨酸的粘附性，在固定及免疫標(biāo)記過程中細(xì)胞不至于脫落。但注意勿使細(xì)胞干燥。
�。�3)組織切片與固體組織：組織切片如為石蠟包埋應(yīng)預(yù)先脫蠟，由二甲苯經(jīng)梯度酒精至水。組織切片與固體組織（勿過大)均應(yīng)以PBS—BSA沖洗，并保持濕潤避免干燥。
2．固定
�。�1)固定前用PBS—BSA沖洗5min×3。
（2)選擇加入適合的固定劑；可為4%多聚甲醛+0.1%～0.5%戊二醛在pH7.4的磷酸緩沖液中。室溫固定10～60min，或4℃30～120min。
（3)PBS—BSA沖洗5min×3。
（4)除去殘留的自由醛基，選以下任一方法：
�、�0.5mg硼氫化鈉/1ml PBS 10min（新鮮配制)
②0.05～0.2mol/l 甘氨醊或賴氨酸—HCl/PBs 30～60min。
③0.1～0.5mol/L氯化鈉/PBs 30～60min。
�、躊BS—BSA沖洗5min×3。
3．免疫標(biāo)記與透射免疫電鏡的原則及步驟基本相同。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com
免疫金銀染色法舉例（張留保等，1997)
�。�1)血細(xì)胞以PBS—BSA沖洗5min×3。
�。�2)2%多聚甲醛—戊二醛混合液固定，4℃，1h
�。�3)PBS或TBS反復(fù)沖洗5min×3。
�。�4)膠體金免疫標(biāo)記程序（略)
�。�5)暗室顯影液顯影
�。�6)掃描電鏡樣品制樣
�。�7)觀察
作者在血細(xì)胞膜外顯示了密集的金銀粒標(biāo)記（特異性標(biāo)記膜的谷胱甘肽過氧化物酶及激素肽)。
4．常規(guī)掃描電鏡標(biāo)本處理
�。�1)PBS—BSA沖洗5min×3。
�。�2)后固定：2.5%戊二醛0.1mol/L磷酸緩沖液，時(shí)間視樣本大小而定，一般室溫30min左右。
�。�3)PBS—BSA洗5min×3。
�。�4)1%四氧化鋨后固定1～2h
�。�5)系列梯度乙醇或丙酮脫水
�。�6)臨界點(diǎn)干燥或冰凍干燥
（7)噴鍍碳與金
�。�8)掃描電鏡觀察
