三、冷凍蝕刻免疫電鏡技術(shù)
冷凍蝕刻法（Freeze Ftching)，也稱冷凍復(fù)型法（Freeze Replica)或冷凍切斷（Freeze Fracture)，是研究生物膜結(jié)構(gòu)的重要方法之一。其主要步驟首先是將樣品在液氮中冷凍，然后放到真空噴鍍儀中切斷，切斷后的切面上有細(xì)胞器，其間還有凍成洋的水分。再加熱使冰升華，將水份蒸發(fā)，把細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)暴露出來，這一步驟就稱為冷凍蝕刻。如不進(jìn)行蝕刻就稱為冷凍切斷。向暴露的膜結(jié)構(gòu)上噴鍍鉑—碳投影，再噴碳來加固。這樣就在切斷的樣品表面形成一層復(fù)型膜。在此復(fù)型膜上印下了細(xì)胞切面的立體結(jié)構(gòu)。從真空中取出樣品，把復(fù)型膜下面的組織腐蝕掉，再把復(fù)型膜撈在銅網(wǎng)上，在透射電鏡下觀察復(fù)型膜。
關(guān)于生物膜的分子結(jié)構(gòu)，目前被大家公認(rèn)的并為冷凍復(fù)型電鏡觀察所證實的是流動鑲嵌型（圖7-1)，即脂質(zhì)—球狀蛋白質(zhì)鑲嵌模型。依照這上模型學(xué)說表明，生物膜是一種流動
圖7-1 生物膜分子的流動鑲嵌模型及冷凍斷裂面圖解
的、可塑的、鑲嵌蛋白質(zhì)分子的脂質(zhì)雙分子層的膜；脂質(zhì)雙分子層中每一分子分別具有兩極，一端為親水極，朝向膜的內(nèi)、外表面，而另一端的疏水極朝向膜的中線部位，兩排分子彼此相對，構(gòu)成生物膜膜性結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)分子彼此相對有嵌入性和表在性兩種，前者大約占蛋白質(zhì)總量的3/4左右，外形近似球狀，鑲嵌在脂質(zhì)分子層的不同深度內(nèi)，而后者則大多附著于細(xì)胞膜的胞質(zhì)面。在冷凍劈裂后，生物膜的水平斷面大多發(fā)生在單位膜的疏水極。因此，膜的親水部，分別命名為PS（與細(xì)胞質(zhì)，核質(zhì)或線粒體內(nèi)基質(zhì)相鄰的面)和ES（與細(xì)胞外間隙或細(xì)胞內(nèi)間隙或細(xì)胞內(nèi)間隙相鄰的面，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、核質(zhì)間隙、線粒體內(nèi)、外膜之間的腔和其它各種泡的腔等)。膜的疏水部、亦即劈裂面分別叫做EF（面向細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)、或線粒體基質(zhì)的面)和PF（向細(xì)胞外間隙或內(nèi)間隙的面)。從70年代初期開始，冷凍蝕刻免疫電鏡技術(shù)已開始在應(yīng)用，但由于免疫標(biāo)記必須在冷凍蝕刻步驟以前進(jìn)行，所以僅能標(biāo)記細(xì)胞外表面（ES)。80年代開始建立了斷裂—標(biāo)記細(xì)胞化學(xué)方法，將細(xì)胞膜劈開后，中央的兩側(cè)斷面（EF與PF)以及各種細(xì)胞器的膜的各個表面及細(xì)胞質(zhì)與核質(zhì)都能被標(biāo)記，為此技術(shù)的廣泛應(yīng)用創(chuàng)造了條件。應(yīng)用此法還可對抗原與受體分子進(jìn)行定量統(tǒng)計。
1．冷凍蝕刻表面標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)
（1)新鮮或固定的細(xì)胞進(jìn)行直接法或間接法免疫標(biāo)記。
（2)PBS（pH7.5)沖洗3min×2，加入1mmol/l MgCl2蒸餾水洗洗3min×3，離心沉集細(xì)胞。
�。�3)將細(xì)胞團置于小紙板上，入液氮冷卻的Freon中，取出入冷凍蝕刻儀中進(jìn)行斷裂操作，再于-100℃蝕刻1min 。
�。�4)制做斷裂面復(fù)型。
�。�5)再次氯酸鈉清洗復(fù)型，蒸餾水洗后進(jìn)行觀察。
本法可顯示斷裂暴露的PF位于中央，周圍則是蝕刻后露出來的ES，標(biāo)記物只出現(xiàn)在ES上。
2．?dāng)嗔选獦?biāo)記免疫電鏡技術(shù)
此法是先進(jìn)行冷凍斷裂，再做免疫標(biāo)記，從而可以對斷裂開的各種膜結(jié)構(gòu)及胞漿斷面進(jìn)行標(biāo)記。
�。�1)臨界點干燥法
�、俟潭ǎ�1.0%～2.5%戊二醛PBS液4℃1～2h，PBS沖洗3min×3。
如為細(xì)胞懸液，可加入30%BSA后加入1%戊二醛，使BSA凝膠化，將凝膠切成2mm左右的小塊，用30%的甘油—PBS浸透后置于用液氮冷卻的Freon中冷卻。
②冷凍斷裂，將冰凍的凝膠小塊放在盛有液氮的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放置于二氧化碳—液氮槽中，用預(yù)冷的解剖刀切割凝膠小塊進(jìn)行冷凍斷裂。
�、劢鈨觯盟閴K于30%甘油—1%戊二醛磷酸緩沖液中解凍。
�、苤脫Q甘油，放入1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油，PBS沖洗，3min×2。
�、菝庖邩�(biāo)記。
�、�1%鋨酸，室溫固定30min。
⑦系列梯度乙醇脫水，臨界點干燥，噴鍍鉑—碳膜，次氯酸鈉清洗復(fù)型，蒸餾水洗，撈于有Formvar 膜銅網(wǎng)上透射電鏡觀察。
（2)超薄切片法
步驟：①至⑤同臨界點干燥法。
�、�1%鋨酸，室溫固定2h，系列酒精或丙酮脫水，常規(guī)電鏡包埋。
�、咔邪氡∑忡R定位合適的斷裂部位，再切超薄切片，鈾鉛染色，透射電鏡觀察。
斷裂標(biāo)記法目前文獻(xiàn)報告應(yīng)用較多的是植物凝集素—膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)，常用的如刀豆球蛋白（Con A)-- 膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)，如第六章 所述，Con A 能與細(xì)胞膜中的甘露糖結(jié)合，能標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核被膜以及細(xì)胞膜的EF面，有助于糖蛋白在超微結(jié)構(gòu)水平的定位。
為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，每組實驗在免疫標(biāo)記階段應(yīng)設(shè)立對照組。對照組的設(shè)計同第一章 總論中的免疫對照染色。
