放射免疫分析時(shí)加入的抗原和抗體的量極微，反應(yīng)所形成的復(fù)合物并不能成為肉眼所能辨認(rèn)的不溶性沉淀物，但是放射免疫分析必須分別測量與抗體結(jié)合的（B)和游離的（F)抗原，所以，B、F的分離是放射免疫分析中的一個(gè)重要環(huán)節(jié) 。根據(jù)抗原—抗體復(fù)合物與游離抗原理化性質(zhì)或免疫學(xué)性質(zhì)的不同，可采取各種分離技術(shù)。
一、對分離方法的要求
分離方法的選擇直接影響分析的質(zhì)量，通常需滿足以下要求：
�、偈笲和F分離完全；②不受外界因素的干擾而影響分離效果；③與游離抗原的非特異性作用盡可能小；④操作簡便，分離迅速，重復(fù)性好，適用于大量樣品分析；⑤來源廣，價(jià)格低廉，便于使用，適合RIA技術(shù)自動(dòng)化。
二、常用的分離方法
目前用于放射免疫測定中的分離方法很多，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，下面介紹幾種常見的分離方法：
�。�1)吸附分離（固相顆粒)
活性碳吸附劑（目前常用)
硅鎂吸附劑（滑石粉等)
交換樹脂吸附劑
�。�2)蛋白沉淀劑
硫酸銨、硫酸鈉
聚乙二醇（PEG)（目前常用)
無水乙醇、丙醇等
（3)免疫分離劑（第二抗體)
�。�4)磁性分離劑
磁化活性碳吸附劑
磁化固相抗體
（5)固相包被分離法（固相分離劑包被在測試管內(nèi))
�。ㄒ�)吸附分離法
這種吸附分離劑是固相顆粒，它可以從反應(yīng)液中吸附游離抗原。
活性炭是常用的吸附劑�；钚蕴慷嘤糜谛》肿佑坞x抗原和抗原—抗體復(fù)合物的分離。具體應(yīng)用時(shí)在活懷炭顆粒的表面涂上一層右旋糖酐或蛋白類化合物。這樣活性炭末的表面構(gòu)成一定大小的孔洞，在反應(yīng)液中加入這種特殊顆粒的混懸液時(shí)，小分子的游離抗原被活性炭吸附，達(dá)到分離B與F的目的。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com
活性炭吸附方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、價(jià)廉，缺點(diǎn)是離心沉淀部分是F而不是B，不適用目前自動(dòng)化放免測定，分離時(shí)易受溫度和時(shí)間的影響。
�。ǘ�)沉淀分離法
沉淀分離法的原理，是鹽類或有機(jī)溶劑能夠破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層而發(fā)生沉淀（這種分離要求蛋白質(zhì)分子處在等電點(diǎn)環(huán)境中)。常用的沉淀劑是聚乙二醇（PEG)。PEG是一種直鏈大分子聚合物，使用PEG溶液時(shí)分離沉淀是在有載體血清蛋白或丙種蛋白存在，而且要求γ球蛋白的最終濃度達(dá)250mg/ml以上的情況下才能實(shí)現(xiàn)。PEG沉淀的結(jié)果易受過量的脂類或離心溫度的變化影響，PEG離心溫度在20℃以下進(jìn)行。PEG沉淀的優(yōu)點(diǎn)是PEG價(jià)格低廉，操作簡便，一次可處理大量樣品。其缺點(diǎn)是PEG單獨(dú)使用時(shí)非特異結(jié)合高，所以常與其它方法聯(lián)合使用；其分離效果易受pH、溫度等影響。
�。ㄈ�)雙抗體分離法
雙抗體分離法也稱免疫分離法，是特異性分離，應(yīng)用十分普遍。本法是以抗IgG抗體和可溶性的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成很大的復(fù)合物而沉淀。很多抗原的特異抗體來自家兔或豚鼠，稱為第一抗體，形成的復(fù)合物不能通過離心將其沉淀�；�?qū)⒌谝豢贵w的同種正常動(dòng)物的血清IgG免疫另一種動(dòng)物所制得的抗體為第二抗體，該抗體與第一抗體形成不可溶的復(fù)合物，經(jīng)離心可將其沉淀，從而達(dá)到分離的目的（圖8-6)。
圖8-6 雙抗體法分離原理模式圖
第二抗體分離的優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好，B和F分離較為完全，非特異結(jié)合低，可同時(shí)處理大量樣品，使用方便。缺點(diǎn)是分離時(shí)間長，非特異性結(jié)合可有較大的波動(dòng)，第二抗體用量較大。
