免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗:第二節(jié)　白細胞介素的檢測

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的白細胞介素（IL)多達10余種，茲舉有代表性的幾種IL檢測法藉以舉一反三。

一、IL-1的檢測

IL-1有兩種分子形式，即IL-1α和IL-2β，它們的生物學(xué)活性基本相同，均可采用生物學(xué)檢測方法進行檢測，若要區(qū)分IL-1α和IL-2β需用免疫學(xué)檢測法。

（一)細胞增殖法

1．淋巴細胞增殖法IL-1具有淋巴細胞活化因子的活性，可以協(xié)同促有絲分裂原刺激T細胞或胸腺細胞發(fā)生有絲分裂，同時IL-1可以刺激T細胞產(chǎn)生IL-2或其它T細胞生長因子，并使之表達相應(yīng)的受體。因此用細胞增殖法檢測IL-1可有直接增殖法和間接增殖法兩種。

（1)直接增殖法：IL-1在促有絲分裂原存在的情況下，能夠促使胸腺淋巴細胞和某些體外建株的T細胞克隆生長，因此測定這些細胞的增殖情況即可反映IL-1的活性。小鼠胸腺細胞測定法操作簡單，比較常用，缺點是缺少特異性，因為IL-2亦可協(xié)同促有絲分裂原刺激胸腺細胞增殖。D10G4.1（一種小鼠T_H細胞克隆)測定法較胸腺細胞測定法的敏感性高，且D10G4.1對IL-2不敏感，因此特異性增強，缺點是需要長期飼養(yǎng)細胞株，該實驗以³H-TdR摻入法或MTT法檢測細胞增殖情況。通常IL-1濃度越高，細胞轉(zhuǎn)化能力越強，IL-1濃度低于0.05ng/ml時，細胞轉(zhuǎn)化能力接近促有絲分裂原單獨刺激的程度。

（2)間接增殖法：某些品系小鼠的T細胞系只有在IL-1存在的條件下才能產(chǎn)生IL-2，并且IL-2的產(chǎn)生量與IL-1的濃度成直線關(guān)系。因此可以利用IL-2依賴細胞株（如CTLL2)測定IL-2，藉以間接測定IL-1的含量。

2．成纖維細胞增殖法IL-1能刺激成纖維細胞的增殖，故可利用來源于新生兒包皮或傳代的人皮膚成纖維細胞（如CRL1445)測定IL-1。國內(nèi)常用小鼠成纖維細胞瘤L929細胞株。m.quanxiangyun.cn/shiti/

檢測原則是將生長成單層的L929細胞用胰酶消化后，配成適當(dāng)濃度的細胞懸液，繼將不同稀釋度的待測樣本與L929細胞懸液分加入96孔培養(yǎng)液中。一式三份，并設(shè)置陰性對照，放入37℃、5％CO₂的溫箱中溫育72h，在第16h時加入適量³H-TdR，繼續(xù)溫育，結(jié)束后離心棄去培養(yǎng)上清，加入適量胰酶消化數(shù)分鐘后，收集細胞測定cpm值或吸光度值。

（二)其他方法

1．骨和較骨組織測定法利用IL-1可誘導(dǎo)膠原酶釋放，破壞軟骨組織的特性，用分光光度計測定軟骨硫酸鹽釋放量，即可間接椎知IL-1量。又如IL-1能影響骨質(zhì)吸收，應(yīng)用放射性⁴⁵Ca通過小鼠頭頂骨系統(tǒng)吸收可測定IL-1活性，為骨質(zhì)吸收釋放法。

2．PGE₂測定法IL-1作用于下丘腦，誘導(dǎo)腦細胞合成前列腺素E₂（PGE₂)，發(fā)揮致熱原作用；還能m.quanxiangyun.cn/Article/誘導(dǎo)原代培養(yǎng)或建株傳代的成纖維細胞產(chǎn)生PGE₂，故可用放免疫技術(shù)測定PGE₂藉以間接測定IL-1。

3．放射免疫測定法本法利用受檢IL-1樣品與碘標(biāo)記IL-1競爭性結(jié)合Sepharose4B中抗IL-1抗體結(jié)合位點的原理而設(shè)計。該法敏感性較高，且可排除樣品中其它干擾因素的影響，其特點是可以區(qū)分IL-1α和IL-1β。

4．體內(nèi)測定法IL-1在體內(nèi)可誘導(dǎo)發(fā)熱、引起急性期蛋白合成及影響血中鐵和鋅水平。實驗室多利用IL-1的致熱原作用加以檢測。在給動物靜脈注射IL-1前后，以體溫的升高幅度表示IL-1的活性，或定期測定血清中某些急性期蛋白的含量，如血清淀粉樣蛋白A，血清淀粉樣蛋白P等。

總之，由于IL-1的生物學(xué)活性比較廣泛，其檢測方法亦多種多樣，但每種方法均有其缺點，往往需要結(jié)合使用。T細胞增殖法簡便、易行且敏感，但樣品中若混有IL-2，則可協(xié)同促有絲分裂原刺激T細胞增殖，從而干擾IL-1的測定。血清中的TNF同樣可以刺激成纖維細胞的增殖，也可用成纖維細胞測定法，但特異性較差。放免法可排除其它因子的干擾，但此法僅測得IL-1的抗原性，不能完全代表其生物學(xué)活性。

二、IL-2的檢測

IL-2的檢測方法主要有兩大類，一類是細胞增殖法，另一類是免疫學(xué)檢測法。

（一)細胞增殖法

IL-2可刺激某些淋巴細胞增殖，根據(jù)細胞增殖情況可反映IL-2的活性，結(jié)果以U/ml表示。目前所用的IL-2反應(yīng)細胞主要有CTLL、CTB6、F12、CTLL-2等小鼠IL-2依賴細胞株以及ConA活化的小鼠淋巴母細胞和小鼠胸腺細胞。這類細胞的增殖情況均可通過顯微鏡下直接計數(shù)、³H-TdR摻入法以及MTT法加以測定。

1．依賴性細胞株增殖法IL-2依賴細胞株在IL-2存在時才能生長，而對PHA、ConA等促有絲分裂原及IL-2以外的其它細胞因子均無反應(yīng)。CTLL-2對IL-2的依賴性最強，表現(xiàn)為在單獨培養(yǎng)時³H-TdR的摻入量低，而在IL-2存在時摻入值高，故為首選的靶細胞株。

2．T淋巴母細胞增殖法T細胞經(jīng)植物血凝素激發(fā)轉(zhuǎn)化為T淋巴母細胞，并表達豐富的IL-2受體，在體外IL-2存在時持續(xù)增殖，并與IL-2含量呈劑量依賴關(guān)系。

3．胸腺細胞增殖法IL-2可以增另ConA的促有絲分裂原作用而引起T血細胞大量增殖。將一定數(shù)量的小鼠胸腺細胞與亞刺激量的ConA和不同稀釋的待檢標(biāo)本共育，在一定時間后檢測IL-2增殖情況即能代表IL-2的活性。胸腺細胞增殖試驗是目前檢測IL-2活性最簡便的方法。此法缺點是敏感性較差，如待測標(biāo)本中存留有ConA會出現(xiàn)較強的非特異性反應(yīng)等。

（二)免疫學(xué)檢測法

根據(jù)抗原－抗體反應(yīng)的原理，可利用抗IL-2的單克隆或多克隆抗體直接測定樣品中的IL-2含量，結(jié)果用ng/ml表示。本法在rIL-2生產(chǎn)制備過程中可用以跟蹤檢測，在rIL-2基因克隆時亦可對陽性質(zhì)粒進行初步篩選。

三、IL-3的檢測

IL-3又名多能集落刺激因子（multi-CSF)，在刺激多能造血干細胞及造血前體細胞的分化及增殖方面具有重要作用。目前檢測IL-3的方法多根據(jù)其對某些IL-3反應(yīng)性細胞促增殖及分化作用而設(shè)計。

IL-3能刺激多種細胞增殖，因此測定IL-3反應(yīng)細胞的增殖情況即可反映IL-3的活性。目前常用于細胞增殖法的IL-3反應(yīng)細胞有骨髓干細胞、骨髓來源的IL-3依賴株及肥大細胞等。此外，也可取小鼠脛骨和股骨骨髓細胞加受檢樣品，制成瓊脂平板，置5％CO₂37℃溫育1周后，計數(shù)集落形成數(shù)，凡細胞數(shù)等于或大于40～50個的細胞團塊計為一個集落，根據(jù)形成集落數(shù)的多少判斷IL-3的活性。

IL-3除刺激骨髓細胞增殖外，也能活化骨髓細胞使其釋放組胺等生物活性物質(zhì)。將小鼠骨髓細胞與不同稀釋度的待檢樣品共溫48h后，用熒光法檢測培養(yǎng)上清中組織胺含量也能反映IL-3的活性。