實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第二節(jié)　在病毒學(xué)中的應(yīng)用

免疫細(xì)胞化學(xué)在病理學(xué)中的應(yīng)用最為廣泛，并取得了很大成果。

一、病毒抗原定位

免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)十分適合于病毒和病毒抗原在組織培養(yǎng)和機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的生長繁殖定位的觀察。

1．

2．先核后漿定位水痘、流感（甲、乙)、雞瘟、假狂犬病、單純皰疹、腺病毒2，3，4，5，7型，多型瘤、勞斯探氏肉瘤病毒，先在核復(fù)制，隨后在胞漿中定位。

3．先漿后核定位痘苗、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹等病毒是先在漿中復(fù)制，后進(jìn)入細(xì)胞核。

4．

5．胞漿內(nèi)定位腮腺炎、新城疫、仙臺(tái)病毒、流感、口蹄疫、鸚鵡熱、狂犬病、小鼠脫足病、痘苗、墨內(nèi)山谷腦炎、馬腦炎、埃及101病毒、黃熱、乙型腦炎、痘病毒、天花等病毒。

二、病毒感染過程

用免疫細(xì)胞化學(xué)方法可以看到病毒從宿主的細(xì)胞到細(xì)胞，叢一個(gè)部位到另一個(gè)部位的擴(kuò)散過程，如用免疫熒光技術(shù)看到了犬肝炎病毒的血行擴(kuò)散；犬瘟熱病毒的淋巴和血行擴(kuò)散。免疫熒光雙重染色法用以觀察雙重病毒感染，如蜱傳染毒（TBE)和麻疹病毒同時(shí)感染羊胚腎細(xì)胞，看到雙重感染細(xì)胞中病毒抗原和核酸的分布不同于單種病毒感染者。

三、腫瘤與病毒

用免疫細(xì)胞化學(xué)可以觀察腫瘤病毒和細(xì)胞，病毒抗原和腫瘤抗原之間的互相關(guān)系。如在不能查出傳染病毒的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了病毒抗原；在典型的肉瘤細(xì)胞胞漿中發(fā)現(xiàn)了勞斯（Rous)氏肉瘤病毒；對EB病毒與非洲淋巴瘤、鼻咽癌和白血病等的關(guān)系進(jìn)行了有價(jià)值的研究，并發(fā)現(xiàn)了與Eb 病毒感染有關(guān)的兩類抗原，調(diào)查了某些疾病病人和正常人血清中抗EB病毒抗體的分布情況。王文亮等在原發(fā)性肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg)和核心抗體。

四、病毒計(jì)數(shù)

五、病毒的快速診斷

免疫細(xì)胞化學(xué)為病毒感染性疾病的快速診斷開創(chuàng)了一個(gè)廣闊的道路（參見表16-2)，最先用免疫熒光法作流感病毒快速診斷，證明有較高的特異性。隨后，對流行性乙型腦炎，脊髓灰白質(zhì)炎、呼吸道和肺炎腺病毒、皰疹病毒等進(jìn)行了臨床快速診斷，提高了診治效果。近年，利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測EB病毒IgA抗體診斷鼻咽癌取得突破性成果，對于早期診治鼻咽癌作出了重大貢獻(xiàn)。在早期診斷流行性出血熱方面，免疫細(xì)胞化學(xué)方法更顯示了其優(yōu)越性，利用感染流行性出血熱病毒的細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本，可以在發(fā)病的早期查出IgM抗體，作出早期快速診斷。檢測患者血清中的抗體和效價(jià)，更有利于病毒感染性疾病的防治，也可直接檢查病變中的病毒。

表16-2 免疫細(xì)胞化學(xué)在病毒學(xué)的應(yīng)用

注：ACIF：抗補(bǔ)體免疫熒光法：DIF：直接免疫熒光；IIF：間接免疫熒光（引自：黃策：免疫熒光和熒光免疫，1983)

作者等用免疫熒光和ABC法在人腎組織中發(fā)現(xiàn)了流行性出血熱病毒抗原。

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)為病毒感染的快速診斷開辟了一條很有希望的道路，一方面可用于病原體檢出，另一方面可用于抗體的檢出。

（一)病毒的檢查

1．原發(fā)感染材料的直接制片檢查取病人或感染動(dòng)物的末梢血液、尿、大便、脊髓液，咽喉鼻腔拭子、含嗽液、表皮病變滲出物、以及尸檢材料等。進(jìn)行直接法免疫熒光染色檢查�？稍�2～3h以內(nèi)得出初步結(jié)果。

2．組織培養(yǎng)物檢查將取自病人或感染動(dòng)物的材料感染培養(yǎng)細(xì)胞，待病毒在細(xì)胞內(nèi)發(fā)育繁殖到一定程度后才能作免疫熒光檢出，一般需10h以上。

3．接種動(dòng)物感染材料檢查將取自病人的感染材料接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如小鼠、雞胚，使其發(fā)病，然后以免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢查實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的各種感染標(biāo)本。

（二)抗體的檢查

用已知病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物為抗原，現(xiàn)酮固定10min，用病人待檢血清與抗原反應(yīng)20min，再用抗人IgG和IgM熒光抗體分別染色30min，按常規(guī)洗滌、裱封、鏡檢。一般需在發(fā)病過程中，前后兩次檢查（急性期和恢復(fù)期各一次)，證明被檢血清的染色強(qiáng)度有4倍以升高時(shí)，方能確定診斷。它比常規(guī)血清學(xué)方法操作簡便，對有些病毒感染敏感性較高。張新生等利用金黃色葡萄球菌表面蛋白A（SPA)能與IgG的Fc段結(jié)合這一特點(diǎn)，用全菌體作為標(biāo)記靶吸附病毒，形成花環(huán)狀結(jié)構(gòu)，再用2%磷鎢酸負(fù)染色后在電鏡下觀察，操作簡便，易于推廣。

（三)常見病毒的快速檢查方法

1．乙型肝炎病毒抗原的快速檢查方法作者用免疫熒光間接法，PAP法和ABC法分別對人活體肝穿刺組織和尸檢的肝炎、肝硬化和肝癌組織、先用10%甲醛固定、石蠟包埋切片，進(jìn)行了乙型肝炎病毒HBsAg、HBcAg 和HbcAb的檢查，在肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了這些抗原或抗體，對診斷和發(fā)病機(jī)理研究有重要意義。

2．狂犬病毒的快速檢查方法可直接檢查活檢和尸檢材料或查角膜印片中的狂犬病毒抗原，用直接法最成功。也可用間接法檢測IgM抗體進(jìn)行早期診斷。最好用免疫熒光法。

3．皰疹病毒的快速檢查方法皰疹病毒（HSV)的抗原用直接免疫熒光檢查，常取眼結(jié)合膜細(xì)胞，皮膚刮片，活檢和尸檢材料。

4．巨細(xì)胞病毒的快速檢查方法用抗補(bǔ)體熒光抗體方法作此病毒抗原的特異性檢查，常取尿沉渣中的細(xì)胞涂片標(biāo)本進(jìn)行檢查。

5．流感病毒的快速檢查方法最早用免疫熒光法檢查流感病毒，一般采用直接法檢查鼻咽部脫落細(xì)胞涂片中的病毒抗原。也可用間接法檢測抗體，必須使用單價(jià)特異性羊抗人IgG熒光抗體，以避免與上皮細(xì)胞上的IgA發(fā)生非特異性熒光。

6．麻疹病毒的快速檢查方法檢查麻疹病人出疹前后的鼻咽部分泌物和眼結(jié)合膜中的細(xì)胞可快速檢出病毒抗原。也可用尿沉渣細(xì)胞標(biāo)本直接法檢出抗原。用間接免疫熒光法可檢出病毒抗體作快速診斷。

7．流行性出血熱病毒快速檢查方法直接法檢查白細(xì)胞中的抗原，單克隆抗體可制備高效價(jià)的熒光抗體。用間接法可快速檢出病人IgM抗體，對病人進(jìn)行早期診斷是我國的創(chuàng)新，世界衛(wèi)生組織向各國推薦。

8．愛滋病病毒抗體免疫熒光檢查方法目前常用以下方法檢查患者血清中的AIDS病毒抗體，對高危人群和可疑患者進(jìn)行病毒抗體檢查具有重要的意義。

抗原片：將AIDS病毒感染的Hu-T-78細(xì)胞用PBS制成懸液，滴于玻片上，吹干，丙酮固定，裝入塑料袋中，密封，-40^℃保存。陰性對照用Hu-T-78細(xì)胞，同上法滴片處理。

間接免疫熒光檢查法。

（1)先將待檢血清用PBS作1：16稀釋，取30μl滴加在抗原片上，m.quanxiangyun.cn放入濕盒，37^。C30min。

（2)用0.01mol/L,PBSPh7.0洗滌2次，每次3min。

（3)滴抗人IgG熒光抗體，濕盒37℃3min。

（4)PBS洗2次，每次3min。

（5)緩沖甘油封片，熒光顯微鏡檢查。

結(jié)果：抗原片細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)彌散熒光，陰性對照無熒光。

9．其他病毒的快速檢查方法腺病，帶狀皰疹病毒，付流感病毒，流行性腮腺炎病毒，呼吸道細(xì)胞病毒，風(fēng)疹病毒，腸道病毒，乙腦病毒，森林腦炎病毒，登革熱病毒等已有報(bào)告用免疫熒光法檢查抗原或抗體作快速診斷。