RIA中放射性碘標(biāo)記

　�。�4)碘化反應(yīng)體積：系指加入Na₂S₂O₅終止反應(yīng)前液體的總量。碘化反應(yīng)體積愈小，局部反應(yīng)物濃度愈高，所得碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白比放射強(qiáng)度就愈高。所以，標(biāo)記應(yīng)采用比放射標(biāo)記效果。當(dāng)反應(yīng)液量少（<0.2～0.3ml)時，反應(yīng)體積對碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)比放射強(qiáng)度的高低影響較大；當(dāng)反應(yīng)液量大（>0.5～1.0ml)時則影響較小。微量氯胺T法放射碘標(biāo)記時，一般多控制碘化反應(yīng)體積<100μl。

　�。�5)碘化反應(yīng)溫度：溫度升高，碘化反應(yīng)速度加快，碘利用率有所增加。但總的來看，反應(yīng)溫度的影響不很大，一般從0^℃到20℃碘利用率相差不過百分之幾，故一般在室溫下進(jìn)行標(biāo)記操作就可能獲得重復(fù)性好的結(jié)果。有些蛋白質(zhì)或肽類極易喪失活性，則可在0℃進(jìn)行碘化反應(yīng)。

　�。�6)碘化反應(yīng)的pH值：受氧化劑氧化生成的活性碘，對多肽鏈的酪氨酸基苯環(huán)羥基鄰位的碘化作用，最適pH是7.3～7.8之間。當(dāng)pH變化時，碘化位置也會發(fā)生變化，例如pH值較高時，組氧酸的咪唑環(huán)也可被碘化；當(dāng)pH4～5時，活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羥基吲哚，導(dǎo)致肽鏈斷裂。這些都會影響蛋白質(zhì)或多肽的放射性碘化反應(yīng)，或引起降解或失活。因此作放射性碘化標(biāo)記時，除放射性碘源外，所有的試劑都應(yīng)用適當(dāng)?shù)木彌_液配制，保證碘化反應(yīng)在最佳pH條件下進(jìn)行。

　�。�7)微量蛋白質(zhì)或多肽的吸附損失：界面的吸附損失，在使用大量蛋白質(zhì)或多肽類時是可以忽略的，但作微量法標(biāo)記時投入的蛋白質(zhì)或多肽類只在微克甚至毫克甚至毫微克水平，界面吸附導(dǎo)致的損失就不能忽略。例如制備¹³¹I—ACTH時，所用ACTH濃度低到50Pg/ml時，因表面吸附可損失10%～30%，甚至高達(dá)75%。改變pH、加入非特異性載體蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時，能減少吸附，但不能完全消除。一般殘留在反應(yīng)管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%～8%、殘留在層析柱上折占5%～10%。殘留量隨標(biāo)記蛋白比放射性強(qiáng)度而直線增減，殘留者幾乎全部都是標(biāo)記蛋白。由此可見，微量蛋白質(zhì)或多肽受吸附而損失的量是不容忽略的。由于微量蛋白質(zhì)、多肽會被顯著吸附而丟失，所以標(biāo)記時投入蛋白質(zhì)、多肽量過微（如<2μg)也是不適宜的，否則標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽的收回率會太低，并在計算上會造成較大的誤差。

　　（8)不同蛋白質(zhì)、多肽碘化標(biāo)記的差別：由于不同的蛋白質(zhì)和多肽分子中含有的酪氨酸數(shù)目不同，而且其空間結(jié)構(gòu)也不相同，分子中的酪按酸殘基有的容易發(fā)生碘化反應(yīng)，有的就不容易碘化，因此同樣條件下進(jìn)行碘化標(biāo)記，不同蛋白質(zhì)或多肽對碘的利用率是不相同的。不同蛋白質(zhì)經(jīng)碘化標(biāo)記后生物活性受損的情況也各不相同。例如ACTH、促性腺激素釋放激素（GRH)、促黃體激素釋放激素（LRH)等多肽，碘化標(biāo)記后容易喪失激素活性或與受體結(jié)合的活性；而AFP及人絨毛膜促性腺激素（HCG)等的碘化標(biāo)記，則較容易保存良好的免疫化學(xué)活性。

　　盡管不同多肽、蛋白度的碘化標(biāo)記結(jié)果有所差別，但上述討論的因素對不同多肽、蛋白質(zhì)碘化標(biāo)記的影響有共同的規(guī)律。掌握了這些因素，就容易成功地獲得合格的標(biāo)記物。

　　不同多肽、蛋白質(zhì)的分子量大小、理化性質(zhì)各不相同，放射碘化標(biāo)記反應(yīng)后，可根據(jù)具體情況采取不同的方法將標(biāo)記蛋白質(zhì)（或多肽)與未反應(yīng)的游離放射性碘及受損傷的標(biāo)記物分開，常用的方法有凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、各種電泳法等。

　�。ǘ�)乳過氧化物酶法（LPO)

　　本法反應(yīng)溫和，對抗原、抗體免疫活性影響小，已被廣泛應(yīng)用。缺點(diǎn)是標(biāo)記率較低，一般為20～40%。

　　1．原理此法是利用乳過氧化物酶（Lactoperoxidase)有促進(jìn)微量過氧化氫對¹²⁵I^-的氧化作用，生成¹²⁵I⁺，并標(biāo)記在多肽、蛋白質(zhì)酪氨酸分子上。

　　2．方法以標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原為例。

　�。�1)反應(yīng)液組成：蛋白質(zhì)2～5μg溶于磷酸緩沖液10～25μl中，加入Na¹²⁵i 1m Ci(10μl)、乳過氧化物酶溶液25ng(10μl)、H₂O₂200ng(10μl)；

　�。�2)在室溫保溫7min；

　�。�3)加入H₂O₂200ng(10μl)；

　�。�4)過7min再加入H₂O₂(3μl)；

　�。�5)保溫7min后，加入0.5ml、10mmol/L巰基乙醇以停止反應(yīng)；

　　（6)10min后加入NaI載體溶液1ml ；

　�。�7)按常規(guī)方法分離純化。

　　3．注意事項

　�。�1)LPO質(zhì)量好壞，可直接影響標(biāo)記率，LPO應(yīng)在使用前新鮮配制，以防酶活性降低。

　�。�2)LPO用量應(yīng)小于總蛋白質(zhì)用量的1%，以減少酶自身碘化而帶入的放化雜質(zhì)。

　　（3)碘化反應(yīng)速率分析表明，酶的催化速度很快。

　�。�4)碘化反應(yīng)在pH4.0～8.5較寬范圍內(nèi)均可進(jìn)行，最適pH值應(yīng)依據(jù)蛋白質(zhì)本身性質(zhì)而定。

　�。�5)H₂O₂應(yīng)保持低濃度，如高于0.1mmol/L，對酶的活性將有抑制作用。

　�。ㄈ�)Iodogen碘化法

　　此法具有標(biāo)記率高、反應(yīng)體積小（3ml水平)、可用低濃度的¹²⁵I原料、對多肽激素和蛋白質(zhì)的免疫活性損失小、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，系常規(guī)的碘化方法之一。

　　1．原理　用Iodogen為氧化劑，對蛋白質(zhì)和多肽抗原進(jìn)行碘化標(biāo)記，把¹²⁵I直接引進(jìn)分子中的酪氨酸殘基上。標(biāo)記過程中被標(biāo)記樣品不與Iodogen混合，標(biāo)記后取出樣品即停止反應(yīng)，不使用任何還原劑。

　　2．方法

　�。�1)標(biāo)記之前，先把Iodogen溶于有機(jī)溶劑，涂于管底，并使之干燥。

　　（2)標(biāo)記時，將蛋白質(zhì)溶液10～20μg/10μl(0.5mol/L,pH7.5PB)置于反應(yīng)管中，反應(yīng)管置于冰浴中。碘化時，¹²⁵I與蛋白質(zhì)克分子之比例為1～1.2。反應(yīng)時間在溫和的連續(xù)的攪拌下可達(dá)10min，從反應(yīng)管中轉(zhuǎn)移出反應(yīng)混合液，使其反應(yīng)停止。反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中，層析分離前再放置5min，使其未標(biāo)記的碘離子還原成分子碘，以避免在帶有緩沖液的柱中使白蛋白碘化。

　　3．注意事項

　�。�1)涂有Iodogen的反應(yīng)管，有氮?dú)庵忻芊�，并貯存在-20^℃條件下，至少可用3個月。打開管，使用時間很短。

　　（2)碘化反應(yīng)時間，7min時標(biāo)記率達(dá)最高，10min時略有減少。PH6.0～8.5時，標(biāo)記率最高。

　�。�3)Iodogen與蛋白質(zhì)的比率是標(biāo)記率的函數(shù)。最大的標(biāo)記率是1克分子的Iodogen與8克分子或再多量之比。

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