（三)半薄切片的IGSS染色
IGSS染色的半薄切片，可以在光鏡下直接觀察陽性結(jié)果，為電鐿取陽性部位及觀察打下良好的基礎(chǔ)。環(huán)氧樹脂會妨礙免疫組化染色。經(jīng)過餓酸處理后固定的組織同樣也會影響抗原抗體反應(yīng)，因此，半薄切片作IGSS染色劑，應(yīng)作以下處理。
（1)脫環(huán)氧樹脂，切片以NaOH的無水乙醇飽和溶液浸泡30～60min，然后以無水乙醇洗5min，兩次，再以95%，80%，70%酒精各洗5min，然后入水。
�。�2)經(jīng)餓酸固定過的切片入1%過碘酸10min（0.5μm厚，時間可隨切片厚薄增減)除去餓酸，然后蒸餾水洗5min，4次。
（3)切片用0.05mol/l TBS,pH7.4洗10min。
�。�4)按石蠟切片第二步往下進行。
三、彩色免疫金銀法（CIGSS)
彩色免疫金銀法（coloured IGSS簡稱CIGSS)是在IGSS基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新方法。其基本原理與彩色顯影相似。IGSS方法染色在抗原位點處生成銀顆粒經(jīng)鐵氰化鉀與溴化鉀的作用即被氧化成溴化銀，后者與彩色顯影劑相接觸立即被還原成金屬銀，而彩色顯影劑本身則被氧化，其氧化產(chǎn)物使彩色成色劑由無色變成有色的染料并沉積在銀顆粒的部位，金屬銀變成了銀離子。由于染料只能通過彩色顯影劑沉積在有銀的部位，所以不與組織發(fā)生非特異性吸附。
以彩色顯影人肝組織內(nèi)HBsAg的操作過程為例：
�。�1)脫蠟至水。
�。�2)0.1%胰蛋白酶37℃10min。
�。�3)Lugol＇s,碘液5min。
�。�4)5%硫代硫酸鈉1min。
�。�5)用0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5min，兩次。
（6)1%卵白蛋白封閉10min。
（7)馬抗HBsAg抗體1：1000稀釋，37℃1～2h 或4℃過夜。
�。�8)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5min，兩次。
（9)1%卵白蛋白封閉10min。
�。�10)PAg 1：40，37℃45min。
�。�11)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5min，兩次。
（12)雙蒸水洗5min，兩次。
�。�13)物理顯影（見P116頁物理顯影配方)。
�。�14)自來水沖洗。
�。�15)雙蒸水洗5min，兩次。
（16)2%鐵氰化鉀和1%溴化鉀，1min。
�。�17)雙蒸水沖洗。
�。�18)彩色顯影（α-萘酚或菲尼酮)2min。
（19)雙蒸水沖洗。
�。�20)2%鐵氰化鉀和1%溴化鉀，1min。
�。�21)2%鐵硫代酸鈉和1%亞硫酸鈉，5min。
（22)流水沖洗。
（23)如需要可用蘇木素或核紅復(fù)染。
（24)緩沖甘油封固，觀察。
結(jié)果：CIGSS的優(yōu)點：①陽性結(jié)果比黑色更鮮明;②可以使弱信號得到放大;③消除IGSS背景染色;④信號/背景比值高;⑤是開展免疫金銀雙標(biāo)技術(shù)的新途徑.光鏡下見HBsAg陽性物質(zhì)呈鮮艷的藍色(α-萘酚為成色劑)或呈綠色(菲尼酮為成色劑)。背景干凈，陽性結(jié)果清楚。
四、免疫金及免疫金銀技術(shù)的優(yōu)點
免疫金銀技術(shù)（Immunogold—sliver Technique)是在免疫金基礎(chǔ)上發(fā)展的新興的先進的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測技術(shù)，它比免疫熒光，免疫酶標(biāo)技術(shù)有許多獨特的優(yōu)點。
1．制備簡單制備膠體金所需要儀器設(shè)備及試劑一般實驗室都具備，市場上也容易購置。制備方法簡單，易行。
2．標(biāo)記簡單抗體、凝集素、酶、SPA、激素等很容易通過物理吸附作用與膠體金顆粒相結(jié)合形成穩(wěn)定的金標(biāo)復(fù)合物。由于在標(biāo)記過程中不需要經(jīng)過任何化學(xué)方法交聯(lián)，抗體的生物活性可保持不變，標(biāo)記方法簡單容易。
3．適用范圍廣 膠體金銀技術(shù)既能用于光鏡也能用于透射及掃描電鏡，同時還可用于X線能譜分析。在熒光顯微鏡上添置一塊特制的濾板（IGs filter block)還可直接對膠體金顆粒進行觀察，金顆粒在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明亮的點狀物，定位準(zhǔn)確，敏感性高，標(biāo)本可長期保存。
4．特異性強免疫金探針的非特異性吸附作用小，較少受生物組織背景因素的影響，在抗原或抗體的檢測中顯示出高度的特異性。
5．敏感性高由于金顆粒的電子密度很大特別適合透射電鏡及掃描電鏡，因此，免疫金銀法用于電鏡，其檢測抗原或抗體率遠遠超過酶反應(yīng)物，從而大大改進了免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在電鏡水平上的分辨率。光鏡下金顆粒經(jīng)過銀顯影后得到放大，用于檢測組織細(xì)胞抗原時其敏感性比PAP法高200倍。我們檢測肝炎表面抗原時比ABC法高6倍，是至今為止最為敏感的免疫細(xì)胞化學(xué)方法，特別適合于檢測微量抗原及石蠟切片標(biāo)本中的微弱抗原。
應(yīng)用彩色IGSS和IGSS雙標(biāo)及多標(biāo)記，可在同一張切片上檢測兩種以上的抗原成份。膠體金可以制備成不同大小的顆粒，將不同直徑的膠體金分別標(biāo)記不同的抗體或抗原，可以在同一張標(biāo)本上同時區(qū)分出兩種或兩種以上的抗原或抗體，非常適用于電鏡水平的雙標(biāo)和多標(biāo)記，為研究細(xì)胞內(nèi)抗原及多種抗原的表達及各種抗原分子相互之間的關(guān)系等提供了最佳手段。
免疫金銀技術(shù)是新興的科學(xué)技術(shù)，目前許多實驗室越來越廣泛地采用這一新技術(shù)，從而使它的發(fā)展有了扎實的基礎(chǔ)。用免疫熒光、免疫酶技術(shù)、放射免疫技術(shù)可做的工作，均可使用免疫金銀技術(shù)。另外，這一新的方法在其它技術(shù)的配合下不斷地得到更新與進步，使它能經(jīng)常增添新的內(nèi)容，特別是免疫金和膠體金示蹤作為一門獨特的新技術(shù)將在生物醫(yī)學(xué)及其它領(lǐng)域的研究中發(fā)揮著越來越大的作用。
