五、在IGSS染色中常見技術(shù)問題和對策
（一)背景染色產(chǎn)生的原因和防止方法
�。�1)第一抗體或金標抗體稀釋度不合適，一般容易犯抗體使用過濃的毛病，認為抗體越濃越好，結(jié)果適得其反。應該先作方陣滴定，優(yōu)選最佳稀釋倍數(shù)（見第一章 )，即可避免非特異性染色，又可節(jié) 省抗體。
（2)使用正常箅清封閉和在抗體稀釋液中加入牛血清白蛋白，可以減少非特異吸附，降低背景染色。
（3)顯色的器皿必須徹底清洗，化學試劑必需用三蒸餾水配制。
�。�4)乳酸銀和硝酸銀的顯色在避光的環(huán)境中反應。醋酸銀則可在有光的環(huán)境中顯色。
（5)顯色時切片應垂直放置在銀顯影液中，使過多的銀顆粒下沉，如水平放置易沉淀于切片上。
（6)控制反應時間，顯影液加入適量的阿拉伯膠或明膠可以延緩反應速度，避免形成過多的還原銀，非特異地吸附在切片上。一般加入明膠1%～2%，效果比較滿意，反應時間根據(jù)室溫而定，室溫25℃左右顯色時間10～15min，室溫在20℃以下，顯色時間20～30min左右。
�。�7)洗滌：使用TBS時最好加入0.05%～0.1%的Triton X-100或Tween 80，可以洗脫掉組織表面發(fā)生非特異性吸附的污染蛋白，防止出現(xiàn)背景的非特異染色。
�。ǘ�)背景染色已發(fā)生應如何消除
（1)2%硫代硫酸鈉，1%鐵氰化鉀等量混合，加在切片上至背景無色為止。
�。�2)2%鐵氰化鉀和1%溴化鉀等量混合作用1min水沖洗，然后加上2%硫代硫酸鈉和1%亞硫酸鈉脫色，至背景干凈為止。
�。�3)0.1%重鉻酸鉀加0.25%濃硫酸，在顯微鏡下控制脫色時間，至陽性結(jié)果清楚，無背景為止。然后用5%硫代硫酸鈉漂白。注意時間不要過長，以免陽性結(jié)果被脫掉。
�。�4)用0.3%～1%的H2O2 處理切片也可消除背景的銀顆粒。但必須在顯微鏡下控制脫水時間，防止把陽性結(jié)果脫色。
�。ㄈ�)彩色顯影背景過染的處理方法
彩色免疫金銀法，在膠體金技術(shù)中是一個很大的突破，它的優(yōu)點是結(jié)果鮮明，對比度好，但是在彩色顯影過程中時間過長，背景可有一些著色，彩色顯影的時間控制很重要。一旦過染可用以下方法處理。
（1)純酒精滴到切片上3～5s,立即沖掉，水洗，充分地把酒精洗掉，如果洗不徹底，造成陽性結(jié)果脫色。
（2)75%的酒精滴到切片上1min，立即沖掉，脫色不能時間過長，過長后陽性結(jié)果全部脫掉。
六、物理顯影液及緩沖液的配制
�。ㄒ�)緩沖液的配制
�。�1)0.05mol/l pH7.4 TBS 配制
Tris（三羥甲基胺基甲烷)12.1g
NaCl 17.5g
加雙蒸水 1900ml
然后用濃HCL調(diào)至pH為7.4再加雙蒸水至2000ml
Tris 4.84g
NaCl 17.5g
BSA 2.0g
NaN3 1.0g
雙蒸水1900ml,充分攪拌至溶質(zhì)完全溶解,用濃HCl調(diào)pH至8.2,再加雙蒸水至2000ml。
�。ǘ�)銀顯影液的配制
1．乳酸銀顯影液的配制：混合以下溶液
①10%阿拉伯膠水溶液60ml
�、阼蹤此峋彌_液pH 3.5 10ml
③對苯二酚1g,加雙蒸水20ml溶解。
④乳酸銀水溶液100 mg加水10ml。
注意在暗處顯影。
2．硝酸銀顯影液的配制
�、�10%阿拉伯膠水溶液60ml。枸櫞酸緩沖液ph 3.5 10ml
�、趯Ρ蕉�1.7g水溶液30ml。
�、巯跛徙y40mg水溶液2ml。
�、佗趦扇芤和耆芙�，臨用前加入硝酸銀溶液。在暗處顯影。
4．彩色顯影液的配制
①0.2N氫氧化鈉的異丙醇溶液5ml溶入100mgα-萘酚（或菲尼酮)。
②500mg碳酸鈉，25mg溴化鉀，50mg亞硫酸鈉，加雙蒸水25ml。
�、佗趦梢�1：10混合，室溫下彩色顯影。
5．醋酸銀顯影液
①15%阿拉伯膠60ml，檸檬酸緩沖液10ml，pH3.5。
②對苯二酚1.7g溶于20ml蒸餾水中。
③醋酸銀100mg溶于蒸餾水10ml中。
用前①②③依次混合，不需要避光，在室溫下顯影。
�。ㄈ�)檸檬酸緩沖液的配制
檸檬酸（C6H8O7.H2O)25.5g
檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7.2H2O)23.5g
加重蒸水100ml溶解即成，pH3.5
(四)氫氧化鈉（NaOH)無水乙醇飽和溶液的配制
8g氫氧化鈉，加入100ml無水乙醇振搖溶解即成。
