（2)二步法：首先用過量的戊二醛與HRP反應（HRP：戊二醛為1：105)，以保證酶分子僅與戊二醛的一個醛基結(jié)合，另一個醛基游離；然后用層析法除去多余的戊二醛，制成活性HRP（HRP-戊二醛復合物)，再加入過量的抗體，使活化HRP上剩余的醛基與抗體蛋白分子上的氨基結(jié)合，制成酶標抗體。過量的抗體可以保證酶與抗體間均勻連結(jié)，避免酶本身聚合。根據(jù)所用的HRP與抗體（IgG)比例不同，酶標記率各異，平均為5%～25%。標記步驟如下：
�、�10～15mg HRP(RZ=3.0),溶解于0.2ml 1.25%戊二醛中（0.1mol/L磷酸緩沖液配制)，18h室溫。
②透析或 Sephadex G-25柱層析（0.15mol/l NaCl平衡)，去除過量的戊二醛，收集活化HRP。
③濃縮活化HRP至10mg/ml左右，加入抗體5mg(1.0ml 0.15mol/L NaCl 溶解)。
④碳酸鹽緩沖液（pH9.5)調(diào)整pH至9.0～9.5,使抗體與活化HRP結(jié)合，4℃24h。
�、菁尤�0.1ml賴氨酸緩沖液，阻斷未反應的醛基，4℃，2h。
⑥用半飽和硫酸銨沉淀5次，對PBS透析24h，4℃，換3次PBS，除去硫酸銨（10000rpm/min,30min)。
�、呋蛴媚z色譜法（Sephadex G-200/Sephacryl S-200) 等分離標記抗體。
注意：該方法要求HRP的RZ值在3.0左右，游離氨基較少，與戊二醛反應后，制成的酶標抗體大部分為單體；而RZ值小于2.8的HRP，含有較多的游離氨基，與戊二醛反應后，易形成多聚體，使方法的敏感性下降。
2．過碘酸鹽氧化法 嚴格地講，過碘酸鈉（Sudium periodate)不是一種真正的偶聯(lián)劑，其本身并非作為橋連結(jié)在抗體和酶之間，而是借助于過碘酸鈉的氧化作用，將酶連結(jié)在抗體上。該方法僅適于含糖較豐富的酶（如HRP)的標記。我們知道，HRP分子的糖本身與酶活性無關，利用過碘酸鈉氧化這部分糖分子內(nèi)的-CH基，使之生成-CHO基，再與抗體蛋白的游離氨基反應，生成Shiff’s堿。此Shiff’堿在pH降低時呈可逆性解離，所以經(jīng)氫硼化鈉（NaBH4)還原，形成穩(wěn)定的酶標抗體復合物（圖4-1)。為防止生成的-CHO基與酶蛋白氨基自身交聯(lián)，預先可用二硝基氟苯（Dintro-fluorobenzene)處理HRP，阻斷分子內(nèi)的ε-、α-氨基。
圖4-1 過碘酸鹽氧化原理
過碘酸鹽氧化法，酶的RZ值≥3時較佳；RZ<3時，糖含量較少，游離氨基較多，氧化時酶易發(fā)生本身聚合，影響酶標抗體的產(chǎn)量，據(jù)報告，適當?shù)乜刂七^碘酸鹽溶液及反應條件，幾乎所加入的HRP和抗體均形成酶標抗體，其標記率為70%左右。具體步驟為：醫(yī)學.全在線www.med126.com
�。�1)4mg HRP(RZ=3.0)溶于1.0ml雙蒸水中。
（2)加0.2ml新鮮配制的0.1mol/LNaIO4，輕輕搖動混合20min,肉眼可見液體內(nèi)棕黃變成深綠色。
�。�3)對0.1mol/L醋酸鹽緩沖液（pH4.4)透析，20h，4℃。
（4)調(diào)整HRP液體的pH至9.5(一般加入20μl0.2mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.5),立即加入抗體(IgG)8.0mg/Fab 3.0mg (0.01mol/L碳酸鹽緩沖液溶解),輕輕混勻后,置室溫2h。PH≤8.5時,抗體的NH2基被氧化生成NH3+,后者不能與CHO基反應,所以,保持pH9.0～9.5非常重要。
（5)加入0.1ml新鮮配制的0.4%NaBH4 溶液，置1～4℃2h，以穩(wěn)定酶標抗體復合物。
�。�6)經(jīng)透析等去除未反應的NaBH4 ，避免還原過度。然后經(jīng)鹽析或柱層析等方法分離酶標抗體（方法同戊二醛法)。
如此制得的酶標抗體，加入終濃度1%牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA)分裝后于-80℃可保存數(shù)年；亦可加入6%等量甘油，混勻置-20℃/4℃保存1年左右。上述兩種標記法是ICC研究中最常用的酶標抗體制備方法。
