【質(zhì)量鑒定】
制備的PAP復(fù)合物應(yīng)檢測(cè)酶和抗體的含量，以鑒定PAP復(fù)合物的質(zhì)量。常用分光光度計(jì)檢測(cè)PAP的復(fù)合物在280nm（IgG的最大吸收波長(zhǎng))和400nm（HRP的最大吸收波長(zhǎng))的光密度值（OD值)，按下式計(jì)算IgG和HRP的含量：
一般HRP/抗HRP的克分子比達(dá)1.9時(shí)，可分裝冷藏于-85℃冰箱，據(jù)報(bào)告如此冷藏的PAP復(fù)合物可保留14年之久，活性無(wú)改變。但稀釋后的PAP復(fù)合物不穩(wěn)定，4℃可保存2～3周。最好臨用前配制。
【PAP復(fù)合物的特征】
PAP復(fù)合物的形成不同于其它抗原抗體反應(yīng)，在抗原稍過(guò)量時(shí)，所有的抗HRP抗體均參與形成可溶性PAP復(fù)合物，僅殘留少許游離的HRP，而大多數(shù)抗原抗體反應(yīng)需要抗原絕對(duì)過(guò)量才能形成可溶性復(fù)合物。PAP復(fù)合物的形狀相當(dāng)穩(wěn)定，不受抗原量的影響，無(wú)論最初加入的抗原抗體過(guò)量與否，最終形成的PAP復(fù)合物其HRP/抗HRP之比絕大部分為3：2。應(yīng)用離心沉降、液相擴(kuò)散等方法分析表明：PAP復(fù)合物沉降系數(shù)為11.5s,分子量為400～430kD，由此可推算出酶與抗體之比為3：2，即每個(gè)PAP生命物由3個(gè)HRP分子和2個(gè)抗HRP抗體組成，呈五角形結(jié)構(gòu)，3個(gè)角為HRP，另兩個(gè)角為抗HRP抗體。采用H2O2-DAB染色，電鏡下已經(jīng)觀察到PAP復(fù)合物五角形環(huán)狀結(jié)構(gòu)，直徑平均21nm 。這種結(jié)構(gòu)異常穩(wěn)定。據(jù)報(bào)告PAP復(fù)合物的抗HRP抗體與HRP結(jié)合常數(shù)為108，在此可溶性復(fù)合物中，即使存在少量游離HRP，亦不影響其穩(wěn)定性。
2．PAP染色原理及步驟
�。�1)原理：與酶橋法相似，都是借助橋抗體將酶連結(jié)在與組織抗原結(jié)合的第一抗體上，所不同的是PAP法將酶橋法的步驟3、4合并為1，用PAP復(fù)合物代替，即第三步用PAP復(fù)合物孵育切片，故稱PAP法。PAP復(fù)合物中的抗HRP抗體和第一抗體為相同種屬動(dòng)物的IgG，所以橋抗體能夠作為“橋”將PAP復(fù)合物連結(jié)在第一抗體上。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com
�。�2)染色步驟：主要步驟與酶橋法相似，如圖4-5。
�、偾衅瑴�(zhǔn)備及第一抗體孵育前處理同間接法；切片與特異性第一抗體孵育同酶橋法。
�、谟眠^(guò)量的橋抗體孵育，作用同酶橋法。
圖4-5 PAP法主要染色步驟
�、塾秒x體制得的PAP復(fù)合物（1：30～300稀釋)孵育1～1.5h（室溫)，使其被橋抗體連結(jié)在第一抗體上。亦可用ALP抗ALP復(fù)合物代替。
�、茱@色觀察等同間接法。
3．PAP法的評(píng)價(jià) PAP法應(yīng)用比較廣泛，特別是近幾年，PAP、ABC等試劑盒商品化，在科研和臨床病理診斷等中有著廣闊的前景。其主要特征和注意事項(xiàng)如下：
�。�1)抗體活性高：非標(biāo)記抗體酶法最大限度地保存了抗體活性，因?yàn)樵谒械姆磻?yīng)過(guò)程中，任何抗體均未被酶連結(jié)，避免了標(biāo)記過(guò)程（共價(jià)鍵連結(jié))對(duì)抗體活性的損害。
�。�2)靈敏度高：靈敏度是指ICC方法所能發(fā)現(xiàn)最少數(shù)量抗原而言。從理論上講，PAP法應(yīng)該較間接法敏感2倍以上，因?yàn)槊笜?biāo)抗體法中，酶與抗體為1：1標(biāo)記，而PAP復(fù)合物含有3個(gè)HRP分子。假設(shè)一個(gè)第一抗體同一個(gè)酶標(biāo)抗體/PAP復(fù)合物結(jié)合，則被連結(jié)于抗原部位的酶分子數(shù)量不同，所以PAP法應(yīng)較敏感。我們知道組織切片抗原的含量是未知的，所以不能直接在切片上檢測(cè)方法的敏感度；但可以假設(shè)相鄰切片抗原濃度相對(duì)恒定，采用相鄰切片染色，以產(chǎn)生特異性染色所用的第一抗體最低濃度作為方法的敏感度，用信噪比（Signal/moise,S/N)表示。據(jù)此，Sternberger(1979)認(rèn)為PAP法較間接法敏感20～25倍，可進(jìn)一步稀釋第一抗體，以節(jié) 省其用量。但實(shí)際上PAP法與間接法之間的差異并非如此明顯。筆者在實(shí)驗(yàn)中注意到，PAP顯示陽(yáng)性的抗原，相同的稀釋倍數(shù)的第一抗體在間接法中亦呈陽(yáng)性反應(yīng)，而時(shí)間陰性時(shí)，PAP法亦為陰性。其原因尚不清楚，可能與橋抗體和第一抗體結(jié)合時(shí)，“剩余”（游離)的Fab段少，PAP復(fù)合物被連結(jié)的相應(yīng)減少有關(guān)。另外 ，PAP復(fù)合物分子量較大（400KD),冰凍切片時(shí)，對(duì)組織穿透性遠(yuǎn)不如酶標(biāo)抗體（分子量90～180kDa)，所以不適于免疫電鏡的標(biāo)本制作。
