�。�2)ALP，是以As-Mx為底物，F(xiàn)B/FR為發(fā)色團(tuán)，生成藍(lán)色/紅色不溶性沉淀。ALP標(biāo)記抗體主要用于內(nèi)源性過氧化酶含量較高的血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的ICC染色。顯色液內(nèi)加入終濃度為2～4mmol/l 的levamisole, 大多數(shù)內(nèi)源性ALP活性可被抑制。通常左旋咪唑（levamisole)以每毫升60～120mmol/L濃度的貯存液-20℃冰箱保存。應(yīng)用時稀釋30倍。為避免反復(fù)稱取，試劑吸水，As-Mx、FR、FB試劑均應(yīng)小量分裝后-20℃冰箱保存，左旋咪唑能抑制內(nèi)源性堿性磷酸酶活性。例如：以每次所用顯色液30ml計算，分裝As-Mx 5～7mg/支、Fr 8mg./支、FB7mg/支，每次使用一支，用前稀釋30倍，過濾顯色 。FR、FB等在光照射條件下易引起沉淀，故顯色反應(yīng)在暗處進(jìn)行。
（3)GOD，是以葡萄糖為底物的酶，其顯色方法為β-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS（Phenazine Methylsulfate)0.167mg,0.05mol/L PB(pH8.3)10.0ml,37℃孵育1h。生成藍(lán)色不溶性沉淀。該終產(chǎn)物不溶于有機(jī)溶劑，切片可脫水透明，長期保存。但GOD的敏感度較HRP和ALP為低，電子供體少，應(yīng)用較局限，主要用于兩種酶的放大技術(shù)，能提高方法和敏感性和特異性。即用GOD和HRP分別標(biāo)記第二、第三抗體（例第一抗體為小鼠單克隆抗體、第二抗體為GOD標(biāo)記的兔抗鼠IgG，第三抗體則為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG)，ICC染色，以葡萄糖-DAB作顯色劑�；驹砣纾▓D4-3)。在這里HRP是作為第二酶系統(tǒng)，利用葡萄糖氧化時生成的H2O2作底物，催化酶促反應(yīng)，不受內(nèi)源性過氧化酶的影響。而且GOD和HRP所標(biāo)記的抗體是結(jié)合在同一抗原位置，所以能良好地顯示組織抗原的存在。其主要染色步驟為：醫(yī)學(xué) 全在.線提供www.med126.com
�、偾衅�(jīng)第一抗的孵育；②漂洗，GOD標(biāo)記的第二抗體孵育40～60min（室溫)；③漂洗，HRP標(biāo)記的第三抗體孵育30～45min（室溫)；④漂洗，顯色、脫水透明觀察同前。
圖4-3 兩步酶催化反應(yīng)原理
二、非標(biāo)記抗體酶法
由于酶標(biāo)抗體存在一些缺點，例如①酶與抗體間的共價連結(jié)可損害部分抗體和酶的活性；②抗血清中的非特異性抗體被酶標(biāo)記后，與組織成分結(jié)合，可致背景染色等。為此Sternberger等在酶標(biāo)法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了非標(biāo)記抗體酶法。包括酶橋法（Enzyme Bridge Method)和過氧化物酶抗過氧化物酶法（Peroxidase Antiperoxidase Method, PAP法)。現(xiàn)分述如下。
�。ㄒ�)酶橋法
1．基本原理 首先用酶免疫動物，制備效價高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體，然后使用第二抗體作橋，將抗酶抗體連結(jié)在與組織抗原結(jié)合的第一抗體上，再將酶結(jié)合在抗酶抗體，經(jīng)呈色顯示抗原的分布。在此過程中，任何抗體均未被酶標(biāo)記，酶是通過免疫學(xué)原理與抗酶抗體結(jié)合，避免了共價連結(jié)對抗體和酶活性的損害，提高方法的敏感性，且能節(jié) 省第一抗體的用量。
2．染色步驟 主要程序如圖4-4
圖4-4 酶橋法主要染色步驟
�。�1)切片準(zhǔn)備及第一抗體孵育前處理同間接法，第一抗體（假設(shè)來自種屬A)孵育24h（4℃)。第一抗體的稀釋度可高些，使抗體的兩個Fab段均與組織抗原結(jié)合，較牢固，漂洗時不易丟失。
�。�2)切片與第二抗體（也稱橋抗體，抗種屬a IgG抗體)孵育1～1.5h（室溫)。應(yīng)用過量的橋抗體能保證一個Fab段與第一抗體結(jié)合，另一個Fab段游離。
（3)切片與抗酶抗體（來自種屬A)孵育1～1.5h（室溫)。因抗酶抗體和第一抗體均系種屬a IgG，具有相同的抗原性 ，所以 橋抗體游離的Fab能與抗酶抗體結(jié)合，起到橋的作用，將抗酶抗體連結(jié)在與組織抗原結(jié)合的第一抗體上。
�。�4)切片與酶（HRp 70～100μg/ml,PBS溶解)孵育0.5h（室溫)，酶與抗酶抗體結(jié)合。
�。�5)顯色等與酶標(biāo)抗體法相同。
酶橋法克服了酶標(biāo)抗體法的缺點，較好地保護(hù)了抗體和酶活性。但仍有其不足：①在酶抗體血清中，含有低親合力和高親合力兩類抗體，它們作為抗原與橋抗體結(jié)合，主要依賴于橋抗體對它的親合力，而與其本身對酶的親合力無關(guān)，故二者均可被連結(jié)在橋抗體上。低親合力的抗酶抗體與酶結(jié)合較弱，漂洗時易解離，使大部分酶（70%左右)丟失，降低了方法的敏感性。②第三步所用的抗酶抗體血清中，亦含有非特異性抗體，其抗原性與抗酶抗體相同，所以能與橋抗體結(jié)合，但不能與酶結(jié)合，影響組織抗原的顯示。為此70年代初，Sternberger(1970)又建立了PAP法，并加以改良，現(xiàn)為ICC研究中常用的方法之一。
（二)PAP法
1．PAP的制備及特征 PAP復(fù)合物是離體制備的HRP抗HRP復(fù)合物，它的制備方法較多，現(xiàn)簡介其中之一。
（1)制備抗HRP血清：健康雄性家兔（2.0kg以上)，可先于足跖皮下注射滅活的卡介苗（共10mg)，2周后重復(fù)1次，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，1周后于背部脊柱兩旁皮內(nèi)多點注射1.0ml乳劑[（福氏完全佐劑，含HRP3.3mg(RZ=3.0)];間隔2周第2次注射，背部注入含HRP3.3mg的不完全福氏佐劑1.0mg；再間隔2周，第3次注射，2mgHRP（溶于2ml生理鹽水中)，分別于前后小腿皮下和背部肌肉內(nèi)多點注射，1周后采靜脈血，檢查效價。再隔1周第4次加強(qiáng)注射（條件同第3次)，一周后檢查抗體效價，瓊脂糖擴(kuò)散法（HRP0.1mg/ml)為1：128以上時，頸動脈取血，制備血清低溫保存?zhèn)溆谩?/P>
（2)制備PAP復(fù)合物：離體條件下，使兔抗HRP抗體與HRP形成可溶性復(fù)合物。在制備抗HRP血清時，HRP的純度要高（RZ≥3)，而制備PAP復(fù)合物時，HRP的質(zhì)量要求不高，甚至可用酶的粗制品。
【步驟】
�、偃�10.50ml抗HRP血清，加7.60ml含7.6mgHRP（1.0mg/ml)的水溶液。
�、诨靹�，室溫1h后，離心16000g 4℃15min。
�、�0.9% NaCl(冷鹽水)溶解沉淀，離心16000g 4℃15min，重復(fù)4次。
④加15.3ml HRP水溶液（含HRP30.64mg)，室溫，持續(xù)攪拌。
�、萦�1N HCl及0.1N HCl調(diào)pH至2.3，沉淀物全部溶解變清，立即用1N 及0.1n NaOH調(diào)pH至7.2。
�、蘼拥润w積的飽和硫酸銨，置0℃45min。
�、唠x心35000g 0℃15min，沉淀用50%硫酸銨漂洗兩次。
�、嘤�10.50ml水溶解沉淀，對透析液（48.6g NaCl, 1.5N NaOOCCH3 30ml, 3N(NH4)2SO430ml, 水5.94L)透析，4℃離心，收集上清，加透析液使體積至10.50ml，分裝低溫保存。
