各論微生物的分離與鑒定
一病原性球菌的檢查
Examination of Pathogenic Cocci
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1掌握病原性球菌的菌落、菌體形態(tài)特征及染色性。
2熟悉病原性球菌的分離培養(yǎng)與鑒定方法。
【實(shí)驗(yàn)原理】
引起化膿性炎癥的球菌，主要有葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌和淋球菌。識(shí)
別化膿性球菌，主要根據(jù)形態(tài)、染色性、培養(yǎng)特征及生化反應(yīng)。除鏈球菌、肺炎鏈球菌及腦
膜炎球菌必須做血清學(xué)分型外，一般無需做抗原分析和動(dòng)物試驗(yàn)。血清學(xué)分型的主要目的是
為了追蹤傳染源，以便加以控制，因此，普通實(shí)驗(yàn)室用之不多。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
一病原性球菌的菌落特征觀察
1葡萄球菌(Staphylococcus)：在血瓊脂平板上培養(yǎng)18～24小時(shí)，形成圓形凸起，表面光
滑；濕潤(rùn)，表面整齊，不透明的菌落。金黃色葡萄球菌金黃色，可產(chǎn)生透明溶血環(huán)；表皮葡
萄球菌白色，無溶血環(huán)；腐生葡萄球菌白色或檸檬色，無溶血環(huán)。
2鏈球菌(Streptococcus)：在血瓊脂平板上培養(yǎng)18～24小時(shí)，形成圓形凸起，半透明或不
透明，灰白色的菌落。甲型鏈球菌不完全溶血，在菌落周圍形成草綠色溶血環(huán)；乙型鏈球菌
完全溶血，形成透明溶血環(huán)；丙型鏈球菌不發(fā)生溶血，無溶血環(huán)。
3肺炎鏈球菌(Diplococcus Pneumoniae)：在血瓊脂平板上培養(yǎng)18～24小時(shí)，形成細(xì)小、
扁平、半透明、灰白色的菌落，菌落周圍有草綠色溶血環(huán)，與甲型鏈球菌相似，培養(yǎng)2～3天
后，因菌體發(fā)生自溶，菌體中央下陷呈“臍狀”。
4腦膜炎球菌(N.Meningitidis)：在巧克力瓊脂平板上加5%CO237℃培養(yǎng)24小時(shí)，形成圓
形、光滑、凸起透明似露球的菌落。在血瓊脂平板上不發(fā)生溶血。
5淋球菌(N.gonococcus)：菌落特征與腦膜炎球菌相同。
二病原性球菌的菌體形態(tài)及染色性觀察
細(xì)菌種類〖〗菌體形態(tài)
〖〗染色性
葡萄球菌〖〗排列不規(guī)則，常呈葡萄串狀，有時(shí)呈鏈狀或散在〖〗G+
鏈球菌〖〗長(zhǎng)短不一的鏈狀排列〖〗G+
肺炎鏈球菌〖〗矛尖狀雙球菌〖〗G+
腦膜炎球菌〖〗腎形或豆形成雙排列〖〗G-
淋球菌〖〗咖啡豆形成雙排列〖〗G-
三標(biāo)本采集
病原性球菌常引起化膿性疾病，分離用標(biāo)本多采用膿液、痰液，也可從分泌物、血液及穿刺
中取材。(1)膿汁：用無菌棉拭挑取患部深處膿液或分泌物，放入無菌試管內(nèi)；(2)痰液：用
消毒過的容器收集病人痰液，以無菌棉拭挑取濃稠痰塊，放入無菌試管內(nèi)；(3)咽部分泌物
：囑病人張開口，用壓舌板壓舌根部，用無菌棉拭從鼻咽部擦拭取材，放入無菌試管內(nèi)；(4
)腦脊液：對(duì)疑患流腦的患者作腰椎穿刺取腦脊液，放入無菌試管內(nèi)，立即送檢；(5)尿道、
陰道分泌物：對(duì)淋病可疑患者，男性可從尿道內(nèi)1—2厘米處取材，女性可從宮頸口取分泌物
，立即送檢。
四病原性球菌的分離與鑒定
待檢標(biāo)本可直接作涂片染色檢查鑒定，必要時(shí)可作分離培養(yǎng)及生化反應(yīng)鑒定。常見病原性球
菌的檢查程序如下：
膿汁、痰、咽部分泌物直接涂片、革蘭氏染色、鏡檢
血瓊脂平板培養(yǎng)觀察菌落性狀、溶血性、色素
挑取可疑菌落涂片染色鏡檢純培養(yǎng)生化反應(yīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
藥敏實(shí)驗(yàn)
血液、穿刺液—→肉湯增菌培養(yǎng)—→培養(yǎng)液涂片染色境檢
二腸道致病菌的檢查
Examination of Enteric Pathogens
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
了解腸道桿菌的生物學(xué)特征、分離與鑒定方法。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
一腸道桿菌形態(tài)學(xué)觀察
腸道桿菌是人和動(dòng)物腸道中的細(xì)菌，多數(shù)為非致病菌或條件致病菌，少數(shù)為致病菌。腸道病
原菌主要是指沙門氏菌屬、痢疾桿菌屬、霍亂弧菌三大重要致病菌。此外，某些致病性大
腸桿菌也可引起腸道感染。腸道桿菌都是革蘭氏陰性菌，形態(tài)、排列相似，但生化反應(yīng)、抗
原結(jié)構(gòu)有差異，因此常用生化反應(yīng)和血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。
二腸道桿菌的分離培養(yǎng)與鑒定
腸道病原菌與常居正常菌群形態(tài)相似，大多為革蘭氏陰性桿菌。因此，對(duì)腸道致病菌的檢驗(yàn)
，首先必須與常居菌區(qū)分開。腸道非致病菌大多數(shù)能分解乳糖產(chǎn)生酸，使指示劑變色，菌
落呈變色反應(yīng)，而致病菌一般不分解乳糖，不產(chǎn)酸，菌落不變色。
1、首先可將標(biāo)本接種于腸道菌鑒別培養(yǎng)基——SS瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，37℃24小時(shí)后觀察菌
落特征。致病菌菌落為無色，非致病菌為粉紅色，從而把大部分非致病菌與致病菌分開。
2、挑取可疑致病菌單個(gè)菌落，以穿刺劃線法接種于半固體雙糖鐵培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)2
4小時(shí)觀察結(jié)果，即通過生化反應(yīng)初步辨別出菌屬或菌種。
3、最后通過特異性的血清學(xué)試驗(yàn)來鑒定菌種、菌型或亞型。必要時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定。
鑒定程序?yàn)椋?/p>
糞便—→SS瓊脂培養(yǎng)—→挑取可疑菌落
血骨髓
—→增菌培養(yǎng)雙糖鐵培養(yǎng)基血清學(xué)鑒定染色鏡檢
生化反應(yīng)
附：SS瓊脂培養(yǎng)基：
①用途：用于分離培養(yǎng)沙門氏菌及志賀氏菌。
②成分：
蛋白胨5g枸櫞酸鐵1g
乳糖10g牛肉膏25g
膽鹽10g0.1%煌綠溶液0.33ml
枸櫞酸鈉10g1%中性紅溶液2.5ml
硫代硫酸鈉10g瓊脂20g
蒸餾水1000ml調(diào)pH7.0
③原理：中性紅在培養(yǎng)基中起指示劑作用，大腸桿菌能分解乳糖產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基pH下降，故
菌落呈紅色；一般腸道致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨產(chǎn)生堿性物質(zhì)，所以菌落呈淡黃色
。膽鹽、枸櫞酸鈉對(duì)一般革蘭氏陽性菌及大多數(shù)大腸桿菌有抑制作用，而對(duì)腸道病原性桿菌
無抑制作用或作用較弱，并且膽鹽有促進(jìn)沙門氏菌、痢疾桿菌生長(zhǎng)的作用。
雙糖鐵培養(yǎng)基：
①用途：初步鑒別腸道革蘭氏陰性桿菌對(duì)糖類的發(fā)酵作用，觀察細(xì)菌有無硫化氫產(chǎn)生，觀察
細(xì)菌有無動(dòng)力。
②成分：含酚紅指示劑［pH8.7(紅色)～pH6.8(黃色)］的pH7.6的蛋白胨水。
硫酸亞鐵氨0.02%瓊脂0.35%
乳糖1%
瓊脂1.3%
③原理：上層中的乳糖用以鑒別腸道桿菌，致病菌不發(fā)酵乳糖，而大腸桿菌則能發(fā)酵乳糖，
產(chǎn)酸而使上層斜面變成黃色。硫酸亞鐵氨用以檢查細(xì)菌分解蛋白質(zhì)后是否產(chǎn)生硫化氫，如
有硫化氫產(chǎn)生則與培養(yǎng)基中的硫酸亞鐵起化合作用而成黑色的硫化鐵。硫代硫酸鈉能起還原
作用，以防止硫化氫被氧化而影響結(jié)果。下層為半固體，可觀察腸道桿菌的動(dòng)力；觀察細(xì)菌
對(duì)葡萄糖分解產(chǎn)酸、產(chǎn)氣情況。
【注意事項(xiàng)】
●腸道傳染病患者的診斷檢驗(yàn)，常是采取糞便標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)。但沙門氏菌感染，特別是
腸熱癥患者，應(yīng)根據(jù)不同病期采取血、尿或骨髓進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。血清做肥達(dá)氏試驗(yàn)(見綜合
性實(shí)驗(yàn)一·七)，以提高檢驗(yàn)的陽性率。
●腸道病原菌的抵抗力比常居菌弱，若糞便標(biāo)本不及時(shí)送檢而放置過久，則由于大腸桿菌等
旺盛增殖，易使病原菌消失或死亡，其中尤以痢疾桿菌最為敏感。為提高痢疾桿菌的培養(yǎng)陽
性率，最好在患者床邊取新鮮糞便標(biāo)本，及時(shí)接種于合適的m.quanxiangyun.cn培養(yǎng)基上。如不能立即培養(yǎng)，
應(yīng)將糞便標(biāo)本置于30%甘油緩沖液中保存。
大腸桿菌、傷寒桿菌和痢疾桿菌的生物學(xué)特征
菌種〖〗形態(tài)、排列及染色性〖〗在SS平板上的菌落特征〖〗含鐵雙糖培養(yǎng)基乳糖〖〗葡萄
糖〖〗硫化氫〖〗動(dòng)力
大腸桿菌〖〗桿狀，散在排列〖〗菌落較大，不透明呈紅色〖〗+〖〗+〖〗-〖〗+
傷寒桿菌〖〗同上〖〗菌落較小，半透明無色或淡黃色〖〗-〖〗+〖〗+/-〖〗+
副乙傷寒桿菌〖〗同上〖〗菌落較小，半透明無色或淡黃色〖〗-〖〗+〖〗+/-〖〗+
痢疾桿菌〖〗同上〖〗菌落小，半透明無色或淡黃色〖〗-〖〗+〖〗-〖〗-
三霍亂弧菌的檢查
Examination of V.cholerae
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
了解霍亂弧菌的檢驗(yàn)方法。
【實(shí)驗(yàn)原理】
對(duì)霍亂病人的診斷檢驗(yàn)，主要靠分離鑒定病原體�；魜y弧菌的主要特點(diǎn)是菌體彎曲呈弧狀或
逗點(diǎn)狀，培養(yǎng)特點(diǎn)是嗜堿怕酸，往往能出現(xiàn)霍亂紅反應(yīng)(即亞硝酸靛基質(zhì)反應(yīng))，抗原構(gòu)造
特異。其診斷檢驗(yàn)方法與一般腸道病原菌不同，主要步驟及特點(diǎn)見下表：
待檢標(biāo)本
(糞便或嘔吐物)
→鏡檢→涂片革蘭氏染色→陰性弧菌
→懸滴(暗視野)→動(dòng)力(+)，制動(dòng)(+)
→培養(yǎng)→堿性蛋白胨水37℃——68h→鏡檢(弧菌，能運(yùn)動(dòng))→堿性瓊脂平板分離培養(yǎng)→霍亂紅反應(yīng)(+)
→堿性瓊脂平板37℃——1024h→鏡檢(弧菌)
→玻片凝集試驗(yàn)(+)
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法】
1鏡檢：注意其形態(tài)和染色特性。
2觀察培養(yǎng)物：該菌在堿性蛋白胨水培養(yǎng)基中呈均勻混濁，有時(shí)
在液體表面生成薄菌膜。
3動(dòng)力檢查和制動(dòng)試驗(yàn)：霍亂弧菌一端有一根鞭毛，在液體中可
活潑運(yùn)動(dòng)，若在上述呈活
潑運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌懸滴中加一滴抗該菌的免疫血清，由于鞭毛與抗體特異結(jié)合，可使細(xì)菌停止運(yùn)
動(dòng)，此為制動(dòng)試驗(yàn)陽性。
①動(dòng)力檢查：用接種環(huán)沾取霍亂弧菌液體培養(yǎng)物一滴，加于玻片中央，置高倍顯微鏡下觀察
，注意是否有穿梭狀活潑運(yùn)動(dòng)。
②制動(dòng)試驗(yàn)：以接種環(huán)沾取霍亂菌液一滴，放于璃片中央，同時(shí)加一接種環(huán)抗霍亂弧菌多價(jià)
免疫血清，混勻后，在高倍鏡下觀察，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)是否被抑制。
四白 喉 桿 菌 的 檢 查
Examination of C.diphtheriae
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
掌握白喉桿菌的一般特征，了解白喉?xiàng)U菌的毒性。
【實(shí)驗(yàn)原理】
白喉?xiàng)U菌屬于棒狀桿菌屬，為革蘭氏陽性的細(xì)長(zhǎng)桿菌，常會(huì)出現(xiàn)多形態(tài)，排列不規(guī)則，有時(shí)
呈柵欄狀，沒有鞭毛、芽胞和莢膜。染色時(shí)菌體著色不均勻，菌體一端或兩端染色與菌體不
同，稱為異染顆粒。
對(duì)白喉?xiàng)U菌的檢查，主要是根據(jù)細(xì)菌形態(tài)，特別是極體的異染特點(diǎn)，此外還可根據(jù)生化反應(yīng)
及毒力試驗(yàn)等進(jìn)行鑒定。
分離培養(yǎng)白喉?xiàng)U菌時(shí)，常用呂氏凝固血清斜面及亞碲酸鉀血平板。在這兩種培養(yǎng)基上，白喉
桿菌生長(zhǎng)較其它菌快，形態(tài)典型。亞碲酸鉀被吸入菌體內(nèi)使菌落呈黑色。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法】
一形態(tài)觀察
觀察白喉?xiàng)U菌革蘭氏染色和異染顆粒染色標(biāo)本。
二白喉?xiàng)U菌培養(yǎng)特征觀察
觀察白喉?xiàng)U菌在呂氏血清斜面和亞碲酸鉀血平板上的菌落特點(diǎn)。
三家兔皮內(nèi)試驗(yàn)法
家兔上皮細(xì)胞受白喉?xiàng)U菌毒素作用后，蛋白質(zhì)合成受阻，從而表現(xiàn)紅腫、壞死，其毒性作用
可被相應(yīng)抗毒素中和而不出現(xiàn)毒性作用。
【材料】
白喉?xiàng)U菌白毛家兔白喉抗毒素注射器
【方法】
1用5毫升鹽水洗下白喉?xiàng)U菌呂氏血清斜面24小時(shí)培養(yǎng)物，制成菌懸液。
2將家兔背部?jī)蓚?cè)的毛剪去，局部皮膚消毒后，在背的一側(cè)皮內(nèi)注射上述菌懸液0.1毫升。
3經(jīng)4～6小時(shí)后，從家兔耳靜脈注入白喉抗毒素1000單位，再將留下的菌懸液在背部另側(cè)
皮內(nèi)注射0.1毫升作為對(duì)照。
【結(jié)果分析】
注射后24、48、72小時(shí)觀察結(jié)果。如試驗(yàn)一側(cè)的注射部位發(fā)生紅腫及壞死現(xiàn)象而對(duì)照的一側(cè)
無此現(xiàn)象者，即為陽性(有毒力)。
四平板毒力試驗(yàn)法
毒素與抗毒素在瓊脂內(nèi)擴(kuò)散相遇，當(dāng)其比例適合時(shí)便形成肉眼可見的特異性沉淀線，本實(shí)驗(yàn)
代替動(dòng)物皮內(nèi)實(shí)驗(yàn)，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便，不需要?jiǎng)游铩Ｇ叶嗾J(rèn)為與動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果相一致。
【材料】
蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基無菌馬(或兔)血清白喉抗毒素待檢菌培養(yǎng)物無菌平皿
【方法】
1制備平板：取胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基10毫升(其中含麥芽糖及乳糖)，加熱溶解，冷卻至50
℃左右，加入滅活的無菌馬(或兔)血清2毫升，混勻(勿出氣泡)，立即傾注平皿內(nèi)制成血清
瓊脂平板培養(yǎng)基。
2加抗毒素：當(dāng)平皿內(nèi)瓊脂尚未完全凝固前，取浸有白喉毒素(500單位/毫升)的無菌紙條(
60×15mm)放于平板中央。待瓊脂凝固后，平板放于37℃孵箱內(nèi)烘1-2小時(shí)(為防止污染，平
板向下)，使培養(yǎng)基表面干燥。
3接種細(xì)菌：將待檢的白喉?xiàng)U菌在與濾紙片呈垂直方向劃線接種于平板面上，接種量宜多
些，同時(shí)
另用能產(chǎn)生毒素和不能產(chǎn)生毒素的白喉?xiàng)U菌按上法劃線接種于其兩側(cè)(呈平行線)，作為陽性
及陰性對(duì)照。
4培養(yǎng)：將接種物放于37℃培養(yǎng)24-72小時(shí)后觀察結(jié)果。
【結(jié)果分析】
在抗毒素紙條與被檢細(xì)菌劃線的交角處有白色沉淀線者，即是該菌產(chǎn)生的毒素與抗毒素在瓊
脂中彌散相遇呈最適比例而出現(xiàn)沉淀線，證明此菌是為產(chǎn)毒株。若不出現(xiàn)沉淀線，則為不產(chǎn)
毒株。陽性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)沉淀線，陰性對(duì)照不應(yīng)有沉淀線。
附：
一呂氏血清斜面培養(yǎng)基
1.成分：1%葡萄糖肉湯(pH7.4)1份，動(dòng)物血清3份。
2.制法：將上述成份混合，并分裝于無菌試管中，每管5毫升；然后斜置于血清凝固器中
，間歇滅菌，第一天75℃經(jīng)1小時(shí)，第二天80℃經(jīng)半個(gè)小時(shí)，第三天85℃經(jīng)半小時(shí)；將培養(yǎng)
基于37℃孵育24小時(shí)，若無雜菌生長(zhǎng)，可供使用。
二亞碲酸鉀血平板
1.成份：肉浸液瓊脂(pH7.4～7.6)100毫升，1%亞碲酸鉀水溶液2毫升，0.5%胱氨酸水溶液
2.制法：加熱溶化已滅菌的肉浸液瓊脂，待冷至50℃左右，加入滅菌的亞碲酸鉀溶液、胱
氨酸溶液及無菌脫纖維血，混勻，傾注平皿。凝固，冷藏備用。
3.說明：
(1)白喉?xiàng)U菌能使亞碲酸鉀還原為碲，故菌落呈黑色。亞碲酸鉀可抑制標(biāo)本中革蘭氏陰性球
菌生長(zhǎng)，有利于白喉?xiàng)U菌的檢出。
(2)胱氨酸和血液都是促進(jìn)白喉?xiàng)U菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物。
(3)胱氨酸及亞碲酸鉀均不耐高溫，應(yīng)用間歇滅菌或?yàn)V菌器過濾除菌。
Examination of Cl.tetani and Cl.perfringens
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1熟悉破傷風(fēng)桿菌及產(chǎn)氣莢膜桿菌的形態(tài)及培養(yǎng)特征。
2熟悉破傷風(fēng)桿菌及產(chǎn)氣莢膜桿菌使動(dòng)物發(fā)病時(shí)的癥狀。
【實(shí)驗(yàn)原理】
厭氧芽胞桿菌屬又稱梭狀芽胞桿菌屬，為革蘭氏陽性桿菌。能形成芽胞，多數(shù)有鞭毛，營(yíng)養(yǎng)
要求不高，但需要嚴(yán)格厭氧環(huán)境。常見的致病菌有破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌和肉毒桿菌等
。
鑒定這類細(xì)菌，主要是根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)特征及生化反應(yīng)，必要時(shí)還需做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢查菌
株的產(chǎn)毒能力。
破傷風(fēng)桿菌是破傷風(fēng)的病原體，常由于外傷后創(chuàng)口被泥土或糞便污染而受傳染。本菌芽胞為
圓形，位于菌體頂端，呈鼓槌狀，周身有鞭毛，在血平板上能溶血，菌落邊緣不整齊，易
向外擴(kuò)散呈羽毛狀。不發(fā)酵牛乳。
氣性壞疽可由多種病原菌引起，尤以產(chǎn)氣莢膜桿菌最為常見。產(chǎn)氣莢膜桿菌無鞭毛，不能運(yùn)
動(dòng)；在一定環(huán)境中形成莢膜，芽胞位于菌體中央或偏端：血平板上形成圓形濕潤(rùn)菌落， 明
顯溶血，能分解糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在牛乳培養(yǎng)基中產(chǎn)生“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
一形態(tài)及染色鏡檢
注意菌體形態(tài)、染色特性，對(duì)比兩菌的芽胞形態(tài)、大小及在菌體中的位置。
二培養(yǎng)及生化特性的檢驗(yàn)
觀察下列培養(yǎng)物的特征：
1肉渣湯培養(yǎng)物：觀察肉渣湯是否渾濁，肉渣色澤是否變化，是否產(chǎn)生氣體。
2血瓊脂平板培養(yǎng)物：觀察菌落特點(diǎn)，有無溶血環(huán)。
3牛乳培養(yǎng)物：是否發(fā)酵牛乳及使酪蛋白凝固，有無產(chǎn)生氣體出現(xiàn)“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象。
4高層葡萄糖瓊脂培養(yǎng)物：有無產(chǎn)生氣體使瓊脂斷裂。
三破傷風(fēng)毒素實(shí)驗(yàn)(見綜合性實(shí)驗(yàn)一第九部分)
四產(chǎn)氣莢膜桿菌動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)
1用滅菌注射器抽取產(chǎn)氣莢膜桿菌肉渣培養(yǎng)物0.2～1.0毫升，注入小白鼠腹腔內(nèi)。
25分鐘后殺死動(dòng)物，送入37℃溫箱中放置5～8小時(shí)。
3觀察動(dòng)物腹部，如有膨脹氣腫現(xiàn)象，解剖檢查見有厭氧芽胞桿菌者，即大致為產(chǎn)氣莢膜
桿菌。
六結(jié)核桿菌的檢查
Examination of M.tuberculosis
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1熟悉結(jié)核桿菌的菌體形態(tài)。
2掌握抗酸染色法的原理及操作過程。
【實(shí)驗(yàn)原理】
結(jié)核桿菌為細(xì)長(zhǎng)的桿菌，有分枝生長(zhǎng)趨勢(shì)。結(jié)核桿菌菌體有一層很厚的臘質(zhì)包膜，不易被一
般染料著色，經(jīng)加溫或延長(zhǎng)時(shí)間才能著色，一旦著色，能抵抗鹽酸酒精的脫色作用，故又稱
抗酸桿菌。分枝桿菌屬細(xì)菌為抗酸菌。
抗酸染色法的原理：石炭酸復(fù)紅在脂類中的溶解度高于鹽酸酒精，結(jié)核桿菌含有較多量的分
枝菌酸及其衍生物，易與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合，所以不被鹽酸酒精脫色，而其它細(xì)菌含脂類
較少，缺乏抗酸性。此外，與結(jié)核桿菌細(xì)胞壁的完整性有關(guān)。抗酸染色法是鑒別結(jié)核桿菌的
重要方法之一，常用的是妻尼(Ziehlneelsen)氏法。
如果痰標(biāo)本中含的結(jié)核桿菌少(含量在105個(gè)/ml以下)，直接涂片法常不易檢出，可用濃縮
集菌
法，即將痰液用4%NaOH或3%HCl處理，溶解標(biāo)本中的粘綢性有機(jī)物，使痰液中包裹的細(xì)菌釋
放出來。然后用離心法或用汽油、二甲苯等作漂浮法集菌，使細(xì)菌濃縮集中，再涂片作抗酸
染色，易找到細(xì)菌。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
一抗酸染色法
【材料】
結(jié)核桿菌(卡介苗)與變形桿菌混合菌液石炭酸復(fù)紅3%鹽酸酒精堿性美蘭
【方法】
1在載玻片上作結(jié)核桿菌、變形桿菌混合菌液涂片，自然干燥后，火焰固定。
2將石炭酸復(fù)紅染液加滿于涂膜部位，經(jīng)15分鐘后用水沖洗。
3滴加3%鹽酸酒精脫色，輕輕晃動(dòng)玻片，直至無紅色流下為止，用水沖洗。
4用堿性美蘭復(fù)染1分鐘后水洗，干燥鏡檢。
【結(jié)果】結(jié)核桿菌呈紅色，變形桿菌呈藍(lán)色。
七嗜酸乳桿菌的分離與鑒定
Isolation and Identification of L.acidophilus
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1熟悉嗜酸乳桿菌分離與鑒定方法。
2了解生物治療劑(微生態(tài)制劑)拮抗病原菌的作用機(jī)理。
【實(shí)驗(yàn)原理】
乳酸菌是一群可發(fā)酵碳水化合物以獲取能量并能生成大量乳酸的一類細(xì)菌的總稱，嗜酸乳桿
菌是其中的一種，主要存在于人和動(dòng)物腸道、口腔和陰道中。現(xiàn)已證實(shí)，嗜酸乳桿菌能產(chǎn)生
細(xì)菌素(蛋白質(zhì)和多肽)，如乳桿菌素A(lactocin A)、乳桿菌素B(lactocin B)、乳桿菌素F(
lactocin F)、aciclocin A、aciclcin B等，具有殺死或抑制其它微生物的生長(zhǎng)。因此，
篩選出強(qiáng)烈拮抗某種病原菌的嗜酸乳桿菌菌株，研制成口服活菌制劑，可用于細(xì)菌感染性疾
病的防治。
采用選擇性的LC培養(yǎng)基及微需氧培養(yǎng)方法，從新鮮糞便標(biāo)本中分離嗜酸乳桿菌。利
用API20A鑒定系統(tǒng)對(duì)分離株進(jìn)行鑒定，并結(jié)合細(xì)菌DNA的G+Cmol%的結(jié)果，鑒定出嗜酸乳桿菌
。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
一培養(yǎng)基配制
【方法】
1稱取適量的LC培養(yǎng)基(胰蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母浸粉5克、葡萄糖10克、醋酸鈉1
5克、磷酸氫二鉀6克、檸檬酸銨2克、MgSO4·7H2O0.57克、MnSO4·H2O 0.12克、FeSO4
0.03克、Tween80 1克)，加入蒸餾水至1000ml，煮沸溶解。
2加入冰醋酸，調(diào)pH為5.5～6。
3100℃(8磅)高壓蒸汽滅菌15～20分鐘。
二嗜酸乳桿菌的分離與鑒定
【方法】
1取新鮮糞便標(biāo)本約黃豆粒大小，加入生理鹽水2ml，混勻，制成懸液。取懸液約0.2ml，
加入裝有2ml的小試管中稀釋，混勻。
2吸取0.1ml稀釋液滴在LC平板中央，用L棒涂開。
3將平板置于厭氧罐內(nèi)，充入混合氣體(80%N2，10%H2，10%CO2)，于37℃下培養(yǎng)3天
。
4挑取可疑單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種至斜面(需純化三次)。
5通過革蘭氏染色(+)、葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)(同型)、厭氧和需氧試驗(yàn)進(jìn)行初篩，再經(jīng)API鑒定
卡鑒定，最后測(cè)定G+Cmo%。
附實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
嗜酸乳桿菌具有以下特征：
①在選擇性LC培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)：菌落細(xì)小(直徑為0.5～2mm)，表面粗糙，園形凸起，
邊緣不整齊。
②菌體形態(tài)：菌體直或微彎，形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，兩端圓，成雙或短鏈，無芽胞。
③革蘭氏染色陽性。
④20種單糖生化反應(yīng)(略)。
⑤G+C mol%為34～37%。
八狂犬病毒包涵體觀察
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
了解狂犬病毒包涵體的特征及病變細(xì)胞的特點(diǎn)。
【實(shí)驗(yàn)原理】
病毒一般需用電子顯微鏡才能看見。電鏡下多數(shù)病毒呈球型，少數(shù)呈絲狀或磚塊狀，細(xì)菌病
毒多數(shù)呈蝌蚪狀。某些病毒在組織細(xì)胞中能形成包涵體(病毒顆粒的集聚體)。將病變材料做
切片或涂片，用麥?zhǔn)匣蚣啡旧ㄈ旧�，普通光學(xué)顯微鏡即可看到。包涵體呈圓形或卵圓形
，大小不等。根據(jù)病毒種類不同，包涵體存在部位(胞漿或胞核內(nèi))及染色性狀(嗜酸性或嗜
堿性)也不同，借此可幫助診斷。
狂犬病毒主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)細(xì)胞中大量繁殖，取病犬腦組織海馬回部切片標(biāo)本
經(jīng)染色后，置油鏡下觀察，可見狂犬病毒包涵體位于胞漿中，染成鮮紅色，呈圓形或橢圓形
。神經(jīng)細(xì)胞呈三角形，細(xì)胞核為藍(lán)色，間質(zhì)為淡紅色。
九乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg的檢測(cè)
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
熟悉ELESA法檢測(cè)乙型肝炎病毒“二對(duì)半”抗原抗體試驗(yàn)原理、方法及結(jié)果分析。
【實(shí)驗(yàn)原理】
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是用酶標(biāo)記的抗體或抗抗體來檢測(cè)標(biāo)本中的病毒抗原或血清抗體
。酶標(biāo)抗體或抗抗體若被待檢的抗原或抗體固定在微孔反應(yīng)板上，當(dāng)加入的酶作用底物后則
出現(xiàn)底物被酶解后的顯色反應(yīng)。該法敏感性高，特異性強(qiáng)，試劑安全、易保存、操作簡(jiǎn)便。
乙型肝炎病毒目前檢測(cè)的方法主要采用(1)血清學(xué)方法檢測(cè)血清中
的乙肝“二對(duì)半”抗原和抗體；(2)PCR檢測(cè)血清中乙肝DNA。
【實(shí)驗(yàn)方法】
1取已知包被抗體(抗HBs或抗HBe的單克隆抗體)，用包被液按1∶100稀釋，然后用100
ul的移液器以每孔0.1ml加于微量反應(yīng)板(聚苯乙烯板)內(nèi)。
2將反應(yīng)板置搪瓷方盤中，放4℃過夜，次日取出甩盡孔內(nèi)液體，用洗滌液洗3次，每次3分
鐘。
3洗滌后，每孔加入待檢0.1ml血清標(biāo)本和HBsAg/HBeAg陽性、陰性對(duì)照血清，將反應(yīng)板置
濕瓷盤中放37℃作用2小時(shí)，取出按上法洗滌。
4加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗HBs(或抗HBe)抗體0.1ml于各孔中，置37℃作用2小時(shí)
，取出洗滌。
5加新鮮配制的鄰苯二胺(OPD)底物0.1ml，放37℃作用30分鐘后加終止液每孔0.1ml。通過
顏色反應(yīng)來判斷結(jié)果。
十衣原體、立克次體、支原體、螺旋體形態(tài)觀察
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1觀察衣原體、立克次體、支原體、螺旋體的形態(tài)特征。
2了解暗視野顯微鏡的使用方法。
【實(shí)驗(yàn)原理】
衣原體包括一類形態(tài)相似，能通過濾菌器，嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，其發(fā)育繁殖有獨(dú)特的生活周期
的微生物，引起沙眼的衣原體可在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體。立克次體是一類生物學(xué)性狀介于細(xì)菌
和病毒之間的、天然寄生于一些節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)的專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物，絕大多數(shù)在光
學(xué)顯微鏡下可見。支原體是一群介于細(xì)菌與病毒之間，能營(yíng)獨(dú)立生活的最小微生物，由于它
們體積微小，且缺乏細(xì)胞壁，普通染色后光學(xué)顯微鏡下不易見到單個(gè)支原體，電鏡可見具有
典型的多形性。在無生命的人工培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)繁殖，形m.quanxiangyun.cn/sanji/成細(xì)小菌落，用低倍鏡觀察可見“
油煎蛋狀”菌落。螺旋體是一類細(xì)長(zhǎng)、柔軟、彎曲呈螺旋狀的單細(xì)胞微生物，
在暗視野顯微鏡下容易觀察到形態(tài)。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
1沙眼包涵體觀察
沙眼病人眼結(jié)膜刮片，經(jīng)姬姆薩氏(Giemsa)染色，沙眼包涵體系嗜酸性胞漿內(nèi)包涵體，染成
藍(lán)色，位于上皮細(xì)胞內(nèi)。
2立克次體形態(tài)及染色性
將斑疹傷寒立克次體給小白鼠腹腔注射，發(fā)病后取腹水涂片，姬姆薩氏染色，鏡
檢。鏡下可見完整或破碎細(xì)胞，細(xì)胞核呈紫紅色或紫色，細(xì)胞漿呈淺藍(lán)色。在大單核細(xì)胞漿
內(nèi)見有大量紫紅色球桿狀立克次體，多位于細(xì)胞漿內(nèi)，呈藍(lán)色或紫紅色。
3肺炎支原體菌落觀察
肺炎支原體在營(yíng)養(yǎng)豐富的固體培養(yǎng)基上增殖多代后在低倍鏡下觀察，其菌落呈“油煎荷包蛋
”狀，菌落中心部分長(zhǎng)入培養(yǎng)基中，且較致密，周圍環(huán)繞扁平、透明的邊緣區(qū)。
4鉤端螺旋體暗視野檢查法
暗視野顯微鏡是將普通光學(xué)顯微鏡換裝上特制的暗視野聚光器或者在普通光鏡聚光器上加一
塊中央遮光板改裝而成。由于光線不能通過聚光器的中心部位透入物鏡，而只能從周邊斜射
經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡，因此視野背景是暗的，標(biāo)本成為亮點(diǎn)。使用暗視野顯微鏡可檢查不經(jīng)
染色，在普通顯微鏡下不易看清的活體微生物，如活的細(xì)菌、螺旋體等，它的缺點(diǎn)是不能觀
察生物體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。
將鉤端螺旋體培養(yǎng)液置清潔載玻片上，加蓋玻片后，用暗視野顯微鏡觀察，可在黑色的視野
中看到發(fā)亮、運(yùn)動(dòng)的鉤端螺旋體。
十一病原性真菌的檢查
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1了解病原性真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和淺部真菌的檢查原則。
【實(shí)驗(yàn)原理】
真菌是一類不含葉綠素，無根、莖、葉分化，由單細(xì)胞或多細(xì)胞組成，行有性或無性繁殖的
真核細(xì)胞型微生物。真菌的種類繁多，大多數(shù)對(duì)人類有利，僅少數(shù)對(duì)人和動(dòng)物致病，稱之為
病原性真菌，包括淺部真菌和深部真菌兩大類。真菌的微生物學(xué)檢查，通常采用直接鏡檢和
培養(yǎng)檢查，根據(jù)真菌特殊的菌絲、孢子形態(tài)和菌落特征來確定真菌的種類。
真菌的菌絲從結(jié)構(gòu)上可分為有隔菌絲、無隔菌絲；從生長(zhǎng)上分為營(yíng)養(yǎng)菌絲、氣中菌絲；從形
態(tài)上可分為梳狀菌絲、球拍狀菌絲、鹿角狀菌絲、結(jié)節(jié)狀菌絲、假菌絲等。真菌的無性孢子
可分為分生孢子(大分生、小分生孢子)和葉狀孢子(芽生孢子、關(guān)節(jié)孢子和厚膜孢子)。真菌
的菌落形態(tài)有酵母菌落、類酵母菌落和絲狀菌落。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
一淺部真菌病臨床標(biāo)本(皮屑)檢查
1標(biāo)本的采�。簶�(biāo)本采取前，應(yīng)忌用藥。發(fā)癬患者，可用拔毛鑷子拔取脆而無光澤、易折
斷或帶有白色菌鞘的病損部毛發(fā)；手、足、體、股癬宜用鈍刀輕輕刮取損害部位邊緣皮屑；
甲癬可用小刀刮取病損指(趾)甲深層碎屑。
2標(biāo)本制作：取少許皮屑或毛發(fā)標(biāo)本于載玻片上，滴加10%氫氧化鈉(鉀)溶液1滴，加蓋玻
片，置火焰上微微加熱(以角質(zhì)細(xì)胞溶解，標(biāo)本透明為宜)，約5分鐘。用鑷子輕輕加壓蓋玻
片，使皮屑鋪開變薄，驅(qū)除氣泡，用濾紙吸取周圍溢液。
3鏡檢：將制好的標(biāo)本片置鏡下，先用低倍鏡下觀察，如疑為菌絲孢子，將視野轉(zhuǎn)向高倍
鏡下觀察。
【思考題】
1、為什么菌絲、孢子絲常作為真菌病診斷的主要依據(jù)?
2、怎樣診斷癬?防治原則有哪些?
(龍北國(guó)張文炳趙衛(wèi))
