免疫學和免疫學檢驗:第二節(jié)　T細胞功能的檢測

T細胞具有多種生物學功能，如直接殺傷靶細胞，輔助或抑制B細胞產(chǎn)生抗體，對特異性抗原和促有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)以及產(chǎn)生細胞因子等，據(jù)此建立了一系列的檢測方法，其中有些已用作臨床檢測細胞免疫功能的指標。

一、T細胞增殖試驗

本試驗又稱T細胞轉(zhuǎn)化試驗。T細胞在體外經(jīng)某種物質(zhì)刺激，細胞代謝和形態(tài)相繼發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為短時間內(nèi)細胞表面電荷即起變化，數(shù)小時后細胞內(nèi)酶活化，在24～48h細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，從而產(chǎn)生一系列增殖的變化，如細胞變大、細胞漿擴大、出現(xiàn)空泡、核仁明顯、染色質(zhì)疏松、淋巴細胞轉(zhuǎn)變成母細胞（圖21-2)。因此，這種淋巴細胞增殖又稱淋巴母細胞轉(zhuǎn)化（lymphoblasttransformation)。淋巴細胞增殖反應(yīng)既可通過形態(tài)學觀察計數(shù)，也可用³H-TdR摻入法檢測細胞內(nèi)DNA合成量的增加，據(jù)此判斷出淋巴細胞對有關(guān)刺激的反應(yīng)性與功能狀態(tài)。

圖21-2 淋巴細胞轉(zhuǎn)化的形態(tài)特征

體外引起淋巴細胞轉(zhuǎn)化的刺激物種類很多，可分為非抗原性刺激物和抗原性刺激物兩類。

1．www.med126.com非抗原性刺激物如植物血凝系（phytoagglutinin，PHA)、刀豆素A（concanavalinA，ConA)、美洲商陸（pokeweedmitogen，PWM)和脂多糖（LPS)等，通稱促有絲分裂原（mitogen)。其中LPS刺激B細胞，PWM可刺激T和B兩類細胞，PHA和ConA刺激T細胞增殖。

2．抗原性刺激物如破傷風類毒素、鏈球菌激酶、純化蛋白衍生物（purifiedproteinderivative，PPD)和白色念珠菌等。同種異型組織抗原也可作為刺激物，例如HLA，用混合淋巴細胞培養(yǎng)法觀察器官移植中受體細胞對供體細胞的反應(yīng)性實質(zhì)上也是一種淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗。

非抗原性刺激物可使正常人外周血中的淋巴細胞引起轉(zhuǎn)化，與機體是否對某種抗原致敏無關(guān)，因此屬非特異的淋巴細胞轉(zhuǎn)化。抗原刺激物的作用只能使相應(yīng)致敏的淋巴細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，因此轉(zhuǎn)化率大大低于非特異性轉(zhuǎn)化。通常應(yīng)用最多的刺激物是PHA，特異性抗原僅使已經(jīng)相應(yīng)抗原致敏的T細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率一般約5％～30％，而且需要培養(yǎng)4～5天。雖然T細胞對特異和非特異性抗原的識別過程不同，但被激活后，誘發(fā)的分裂和增殖過程卻是相同。因此根據(jù)非特異性促有絲分裂原激活T細胞增殖反應(yīng)的程度，同樣可推測T細胞識別特異性抗原增殖反應(yīng)。目前淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗是判斷T細胞功能的一項常用的非特異性體外免疫學檢測指標。

該試驗有形態(tài)計數(shù)法和同位素計數(shù)法兩種。

（一)形態(tài)法

其原則是將外周血液或分離的單個核細胞與適量的PHA混合，置37℃培養(yǎng)72h，取培養(yǎng)細胞作涂片染色鏡檢。根據(jù)細胞的大小，核與胞漿的比例，胞漿的染色性和核結(jié)構(gòu)以及有無核仁等特征，分別計數(shù)淋巴細胞、過渡型母細胞和核有絲分裂相細胞以及成熟的小淋巴細胞，以前三者為轉(zhuǎn)化細胞，每份標本計數(shù)200個細胞，按下列計算轉(zhuǎn)化率：

轉(zhuǎn)化率＝轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)／（轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)＋未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù))×100％

在正常情況下，健康人外周血經(jīng)PHA刺激的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率為60％～80％，小于50％可視為降低。形態(tài)學方法簡便易行，便于基層實驗室推廣采用，但判讀結(jié)果受主觀因素影響較大，有些細胞形態(tài)難以確認，因此重復性和可靠性較差。

（二)同位素法

絕大多數(shù)外周血中T細胞通常處于細胞周期的G₀期，受特異性抗原或促有www.med126.com絲分裂原激活后，從G₀期進入G₁期，并合成蛋白質(zhì)、RNA和DNA前體物質(zhì)等，為DNA復制準備物質(zhì)基礎(chǔ)，然后進入S期，細胞合成DNA量倍增，此時若在培養(yǎng)液中加³H標記的DNA前體(³H胸腺嘧啶苷，³H-TdR)，后者即摻入新合成的DNA中，根據(jù)摻入的多少推測細胞增殖程度。檢測原則是將全血或分離的單個核細胞懸液加入含培養(yǎng)液的試管中，每份樣品分實驗管和對照管，實驗管加最適量和亞適量PHA后，移置5％CO₂溫箱37℃培養(yǎng)56h，加適量³H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)16h，結(jié)束后將細胞收集在玻璃纖維膜上，遞經(jīng)處理，最后用液體閃爍器測量，記錄每分鐘脈沖數(shù)(cpm)，算出3個復管的均數(shù)±S。通常以刺激指數(shù)(SI)表示轉(zhuǎn)化能力。

SI＝PHA刺激管cpm均值/對照管cpm均值

由于對照管組和刺激組實驗條件一致，故用SI表示淋巴細胞增殖能力可以減少可變因素的干擾，但對照組同位素摻入量的增加或減少，能使SI發(fā)生明顯變動，以致有時不能反映真實的增殖情況，因此最好同時參照對照組和實驗組的cpm加以判斷。值得強調(diào)的是目前配制的PHA多為最適濃度，在該條件下，功能略遜的細胞仍有應(yīng)答能力。如同時采用最適和亞適濃度，一些細胞免疫功能較低的T細胞對亞適濃度的PHA則缺乏或僅呈極弱的應(yīng)答，故在一定程度上可識別出應(yīng)答功能較差的T細胞群。

二、T細胞介導的細胞毒試驗

T細胞介導的細胞毒性（lymphocytemediatedcytotoxicity，LMC)是細胞毒性T細胞（CTL)的特性，凡致敏的T細胞再次遇相應(yīng)靶細胞抗原，可表現(xiàn)出對靶細胞的破壞和溶解作用，它是評價機體細胞免疫水平的一種常用指標，特別是測定腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細胞的能力，常作為判斷預后和觀察療效的指標之一。該試驗的原則是選用適當?shù)陌屑毎�，常用可傳代的已建株的人腫瘤細胞如人肝癌、食管癌、胃癌等細胞株，經(jīng)培養(yǎng)后制成單個細胞懸液，按一定比例與受檢的淋巴細胞混合，共溫一定時間，觀察腫瘤細胞被殺傷情況，常用方法如下：

（一)形態(tài)學檢查法

淋巴細胞與腫瘤細胞混合共育后，以瑞氏染液著色，用顯微鏡計數(shù)殘留的腫瘤細胞數(shù)，計數(shù)淋巴細胞抑制腫瘤細胞生長的抑制率：

抑制率％＝（對照組平均殘留級腫瘤細胞數(shù)－實驗組平均殘留細胞數(shù)／對照組平均殘留腫瘤細胞數(shù)×100％

（二)同位素法

一般采用¹²⁵I-UdR摻入法或⁵¹Cr釋放法，以細胞毒指數(shù)或⁵¹Cr釋放率表示T細胞的細胞毒活性。